目的:牙周病是由牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌等多种牙周致病菌单一或独立引发的牙周支持组织感染性疾病。随着炎症的进一步扩展,牙周膜、牙槽骨等牙周主要支持组织发生破坏,患牙通常可表现牙齿松动、牙龈红肿或出血,其咀嚼功能下降或完全丧失。鉴于上述病理特征,牙周炎已经成为造成当代成年人牙列缺损的主要原因。除影响咀嚼功能外,牙周炎亦可对患者的美观、发音甚至心理状态产生较大的影响。这也是当下口腔医师需要重点关注的问题。研究证实,B细胞所主导的适应性免疫反应是牙周组织损伤的主要原因。因此剖析B细胞功能对研究牙周组织稳定具有重要意义。B10细胞是调节性B细胞的功能性亚群之一,以表达较高水平的IL-10为主要特征。虽然B10细胞的功能尚未完全明晰,但已有研究证实该亚群在感染性疾病、自免疫疾病甚至肿瘤等疾病的病理进程中均发挥重要作用。B10细胞调控牙周炎症反应可基于两条途径,一是表达IL-10影响牙槽骨稳态,二是调控其它免疫细胞影响免疫反应。然而B10细胞在牙周炎时的动态变化以及其对局部免疫的调控效应及机制仍未完全明确。本研究以牙周炎病理模型为分析对象,通过动物实验及细胞实验,采用ELISA、Flow cytometry、实时荧光定量PCR以及western blot等多种免疫研究技术分析并说明牙周炎对B10细胞的影响以及B10细胞调控牙周炎宿主Th17/Treg的效应及机制,以期为后续研究提供参考。研究方法:本研究由以下三部分组成:1.牙周致病菌对宿主B10细胞分化及功能的影响及机制我们首先建立了牙周炎动物模型。提取模型动物与健康动物的牙龈及外周血中的淋巴细胞,分析不同状态下不同组织内IL-10+B细胞的变化趋势及特点。另取健康的脾源性B细胞,在常规条件下以及在Pg-LPS诱导下培养一周后分别采用流式细胞术、ELISA以及实时荧光定量PCR从基因及蛋白水平评价各培养条件下B细胞表达分泌IL-10的水平。本部分拟揭示牙周炎宿主B10细胞的变化特点并分析牙周致病菌对该细胞分化及功能的影响。2.B10细胞调节Th17/Treg在牙周炎宿主免疫中的效应研究取前一步实验中经牙周致病菌活化的B10细胞,以1*106个/m L剂量经尾静脉回输建立过继转移模型。分别采用健康动物以及过继转移动物建立牙周炎模型,以健康动物为对照。分别取各组动物牙龈、龈沟液及外周血液,采用上述免疫分析技术评价局部及外周组织中Th17/Treg的表达水平以及相关细胞因子RANKL、TGF-β、IL-6、IL-10以及IL-17A的表达水平,以期明确B10细胞在牙周炎发展过程中对宿主免疫的调控效应。3.B10细胞调控Th17/Treg分化的机制研究分取健康动物源性B10细胞及Th0细胞,分别在常规条件以及伴Pg-LPS条件下进行共培养。采用流式细胞术探索各组CD4+IL-17+细胞、CD4+IL-10+细胞、CD4+TGF-β+细胞比例,采用ELISA法分析各培养基中IL-10、TGF-β以及IL-17A浓度,并采用实时荧光定量PCR法检测细胞内IL-10、TGF-β以及IL-17A m RNA表达水平。并采用western blot评价各细胞内IL-10Rα的表达水平以及其与上述指标的关系。本部分研究拟通过研究说明B10细胞调控Th17/Treg分化的特点以及潜在的机制。结果:1.无论是健康个体还是牙周炎宿主,均可在其牙龈及外周血液中检测到B10细胞的存在。在牙周炎时,局部组织内B10细胞比例显著升高,但在外周血中却并未发现上述变化。在牙周炎进程中,B10细胞的迅速升高更多的体现在疾病早期,在病程晚期上此变化趋于平稳。将初始B细胞与牙周致病菌共培养,其内的B10细胞分化水平显著升高,细胞内IL-10 m RNA水平以及培养基中IL-10浓度也同时升高。2.B10细胞过继转移下调了受体模型动物局部组织内Th17比例,同时在一定程度上补偿了Treg的失调。在牙龈中,B10细胞过继转移显著下调了RANKL及IL-17A这两类促炎因子的表达水平,同时上调了IL-10的表达水平。相比于常规牙周炎模型,过继转移组实验动物龈沟液内RANKL及IL-17A降低、IL-10升高。3.在共培养体系下,B10细胞可同时上调CD4+IL-10+细胞、CD4+TGF-β+细胞比例,下调CD4+IL-17+细胞比例;同时提高培养基内IL-10、TGF-β浓度及T细胞内其m RNA水平,并降低培养基内及细胞内IL-17A及其m RNA水平。当Pg-LPS存在时B10细胞降低了CD4+TGF-β+细胞比例,但不影响培养体系中TGF-β的浓度。Pg-LPS还促进了Th17的分化以及IL-17的表达,并伴随有T细胞表达IL-10Rα表达水平及磷酸化的提高。结论:1.牙周致病菌促进宿主B10细胞分化及功能。2.B10细胞可调控牙周炎宿主局部Th17/Treg比例及功能状态。