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目的:探讨POSTN调控人脐带来源间充质干细胞免疫调节作用及治疗aGvHD的疗效与机制。内容:1.构建sh-POSTN慢病毒载体转染hUC-MSC;2.体外实验探讨POSTN调控hUC-MSC一般生物学特性和免疫调节作用;3.利用小鼠aGvHD模型探究POSTN调控hUC-MSC治疗aGvHD的疗效与机制。方法:1.体外培养hUC-MSC,同时构建sh-POSTN慢病毒载体和sh-NC对照慢病毒载体感染293T细胞。倒置荧光显微镜、流式细胞术检测慢病毒感染效率;实时荧光定量PCR(q-PCR)检测感染病毒细胞的POSTN表达水平。筛选稳定敲低POSTN(sh-POSTN)慢病毒载体和对照病毒载体(sh-NC),感染hUC-MSC并扩增培养,采用吉姆萨染色、流式细胞术检测比较hUC-MSC、sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC的形态与细胞表型。2.体外培养的sh-POSTN-MSC和sh-NC-MSC进行成脂、成骨诱导分化,油红O染色、碱性磷酸酶染色法检测脂滴数和碱性磷酸酶的表达,q-PCR检测成脂和成骨分化过程中关键转录因子PPARγ、ADI、ALP、OPN的表达水平;流式细胞术检测两组细胞的细胞周期,CCK-8法检测细胞的增殖能力。3.体外将小鼠T淋巴细胞与hUC-MSC、sh-NC-MSC、sh-POSTN-MSC共培养,CFSE染色法检测T淋巴细胞的增殖能力,q-PCR检测共培养后T淋巴细胞中TNF-α、IFN-γ、Foxp3、IL-2、IL-17等炎症因子和PARP-1、CASP3(Caspase-3)、AIFM1等凋亡相关基因的表达;Anniex V/PI染色法检测共培养后T淋巴细胞发生凋亡情况;CMTMR染色法比较各组细胞对T淋巴细胞的粘附能力;进一步采用q-PCR法检测各组细胞的免疫相关基因CCL2、CCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IDO的表达。4.利用Co60γ照射建立小鼠急性移植物抗宿主病(aGvHD)模型,并于建模48 h后,通过尾静脉分别输注hUC-MSC、sh-NC-MSC、sh-POSTN-MSC和PBS进行治疗。通过观察记录治疗后小鼠的体重、生存率和临床表现评分评估一般生存状态;HE染色比较各组小鼠的肝、肺、小肠及肛周皮肤病理变化和炎性细胞侵润;q-PCR法检测各组小鼠脾脏TGF-β、IFN-γ、IL-6、Foxp3等炎症因子表达情况。结果:1.成功构建sh-POSTN和对照sh-NC慢病毒载体,转染293T细胞后,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光细胞,流式细胞术检测绿色阳性率>90%;进一步将sh-POSTN或sh-NC的慢病毒转染hUC-MSC,荧光显微镜结合流式细胞术分析转染效率>90%。q-PCR检测POSTN敲低效率,结果显示,转染细胞POSTN的表达较对照细胞显著降低,Western Blot检测结果证实POSTN的蛋白表达亦显著降低,以上结果说明我们成功获得POSTN敲低的hUC-MSC(sh-POSTN-MSC),同时获得对照组细胞sh-NC-MSC。2.为探究POSTN是否影响hUC-MSC的一般生物学特性,我们体外培养sh-POSTN-MSC和sh-NC-MSC,从形态、细胞表型和诱导分化三个方面进行鉴定,结果表明,培养的细胞呈纤维样、长梭形、旋涡状生长;流式细胞术检测细胞表型,结果显示,细胞高表达间质细胞表面标志CD73、CD90、CD105,低表达或不表达单核细胞表面标志CD14和造血细胞表面标志CD34、CD45。体外成脂肪和成骨诱导分化结果显示,油红O染色可见细胞出现大量的红色脂滴,碱性磷酸酶染色可见细胞呈蓝紫色;q-PCR检测成脂关键转录因子PPARγ、ADI以及成骨分化关键转录因子OPN和ALP的表达均显著上调,证实培养的各组MSC均具有成脂和成骨分化的能力,但sh-POSTN-MSC的成骨分化能力显著下调,提示POSTN影响MSC的成骨分化。进一步,流式细胞术检测培养细胞的细胞周期,结果表明,sh-POSTN-MSC的G0/G1期比例相对下调;CCK-8检测细胞的增殖能力亦较对照组显著减弱(P<0.05)。上述结果证实sh-POSTN-MSC和sh-NC-MSC具有MSC的一般生物学特性,但POSTN影响hUC-MSC的成骨分化和细胞增殖能力。3.为探究POSTN是否影响MSC的免疫调节作用,我们将sh-POSTN-MSC和sh-NC-MSC与小鼠的T细胞共培养,流式细胞术检测T细胞的增殖能力,结果显示,sh-POSTN-MSC组T细胞增殖能力(65.1±7.36%)较sh-NC-MSC组(49.6±4.12%)和hUC-MSC组(46.7±6.14%)显著升高(P<0.001),提示sh-POSTN-MSC抑制T细胞增殖的能力显著下降;q-PCR检测相关炎症因子的表达,结果表明,与sh-POSTN-MSC共培养的T细胞,其TNF-α的表达较对照组显著上调(P<0.05);进一步检测共培养后各组T细胞的凋亡情况,结果表明,与hUC-MSC组和sh-NC-MSC组相比,sh-POSTN-MSC组T细胞凋亡比例显著下降(P<0.001);黏附实验结果显示,sh-POSTN-MSC组T细胞黏附数量较hUC-MSC组和sh-NC-MSC组显著降低(P<0.05),提示sh-POSTN-MSC黏附T细胞的能力降低;q-PCR检测相关免疫调节因子的表达,结果表明,sh-POSTN-MSC组CXCL10的表达较对照组显著下调(P<0.05),提示其对T细胞的趋化能力降低。4.为探讨POSTN调控MSC治疗aGvHD的疗效和作用机制,我们利用小鼠aGvHD模型,分别输注sh-POSTN-MSC、sh-NC-MSC、hUC-MSC、PBS进行治疗,结果表明,各组小鼠体重均先下降后缓慢升高,其中hUC-MSC组、sh-NC-MSC组和sh-POSTN-MSC组体重恢复均显著高于PBS组,且hUC-MSC组、sh-NC-MSC组体重均大于sh-POSTN-MSC组,但无统计学差异。治疗后第21d起,sh-POSTN-MSC组小鼠的生存率显著低于hUC-MSC组和sh-NC-MSC组,但显著高于PBS组;治疗后的第14 d和21d,sh-POSTN-MSC组小鼠临床评分结果显著高于hUC-MSC组和sh-NC-MSC组,但显著低于PBS组,提示sh-POSTN-MSC组小鼠一般生存情况较差;HE染色检测各组小鼠病理学改变,结果显示,与hUC-MSC组和sh-NC-MSC组相比,sh-POSTN-MSC组小鼠的肝、肺、小肠及肛周皮肤病理损伤和炎性细胞侵润较严重;初步机制探讨结果显示,sh-POSTN-MSC组小鼠脾脏T淋巴细胞TGF-β的表达较其它组显著下降(P<0.05)。结论:POSTN影响hUC-MSC的成骨分化和T细胞的增殖,其可能通过调控T细胞的趋化和黏附作用进而影响hUC-MSC治疗小鼠aGvHD的疗效。