研究背景:昼夜节律（circadian rhythm）是指生命活动呈现出约为24小时周期的昼夜交替性节律。正常的昼夜节律可维持机体的多种生理功能,调节机体应对外界环境的变化。昼夜节律受机体内部因素（如激素分泌、疾病影响等）和外部因素（如光照条件、温度变化等）共同维持调节。生物钟主要由生物钟基因组成的转录和翻译负反馈调节环路调控产生。当机体内源性因素或外界环境因素突然改变,如跨时区飞行和倒班工作等所导致的外界光照条件的改变,此时生物钟的平衡就会被打破,并导致昼夜节律紊乱。倒班和跨时区飞行所导致的生物钟相位失调,是产生生物钟相关疾病的最主要原因,因此对生物钟进行相移调整是治疗相位失调相关疾病的重要手段,故研究探索新型特效调节生物钟时相的药物十分重要。此外,低氧是导致昼夜节律紊乱的重要因素,哺乳动物体内生物钟系统和氧感知通路的关键基因均是PAS家族成员,故低氧与生物钟也密切相关。因此,研究高原低氧环境下生物钟变化特征,开发有效干预治疗药物,对于提高官兵在低氧环境下的军事作业能力具有重要意义。磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂通过抑制体内PDE5的活性,从而调节cGMP水平。已有文献报道PDE5抑制剂西地那非通过调控视交叉上核（SCN）生物钟基因促进小鼠的昼夜节律相位前移。TF是我国自主研发的新型PDE5抑制剂,属1.1类新药,相比于西地那非具有选择性更高,半衰期更长等优点。在昼夜节律调整方面,TF是否优于西地那非,目前尚不清楚。肝脏作为机体最重要的代谢器官之一,有着其自身的震荡规律,能响应SCN的调节,与其他外周器官共同维持稳定的昼夜节律,故TF能否通过调控肝脏生物钟基因发挥功能,未见报道。此外,由于PDE5抑制剂具有显著的抗低氧性肺动脉高压作用,但其能否缓解低氧条件下的昼夜节律紊乱,未见相关文献报道。研究目的:本课题通过体内、体外实验两个方面,研究常氧和低氧条件下TF对机体昼夜节律的调节作用,并探索其相关机制。进一步与传统PDE5抑制剂西地那非进行相关药效的优劣性比较,期望为倒班工作、跨时区飞行及高原低氧等不同因素下昼夜节律紊乱的治疗提供新的治疗药物和干预措施。研究方法与结果:1、首先在细胞水平,在常氧条件下,利用Lumicycle设备研究PDE5抑制剂对转染含Bmal1或Per2荧光素酶的人源骨肉瘤细胞系（U2OS）生物钟周期、振幅及相移的影响,结果显示,PDE5抑制剂对C26（Bmall1::luc U2OS）细胞生物节律的周期、相位、振幅并无影响,而对D15（Per2::luc U2OS）细胞的相位有约3.6 h的相移作用。2、在动物水平,通过小鼠跑轮行为学实验,验证上述实验结果。控制昼夜光照时间使C57BL/6J小鼠形成稳定的12h/12h明暗昼夜节律后,将开灯时间提前8h,通过记录小鼠的跑轮活动,分析小鼠每天的相移情况及同步至新节律周期所需时间。实验结果显示,与对照组相比（9.400±0.548天）,PDE5抑制剂能促进小鼠的昼夜节律相位前移,且TF（7.200±1.304,P=0.013）比西地那非（7.400±1.517天,P=0.022）的促进效果更好。3、在分子水平,研究PDE5抑制剂调控昼夜节律相位前移的作用机制。与行为学条件一致,在开灯时间提前的同时,进行PDE5抑制剂灌胃给药。通过qPCR,WB方法,在m RNA和蛋白质水平研究PDE5抑制剂对小鼠肝脏生物钟的作用。实验结果显示,与对照组相比,PDE5抑制剂可使小鼠肝脏中的生物钟正调节因子Bmal1、Naps2、Clock、Rorα的m RNA和蛋白表达水平呈现显著上调,负调节因子Per2和Rev-erbα的m RNA和蛋白表达水平均显著下调。4、低氧条件下,首先在细胞水平,给予脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG用于模拟低氧环境,研究PDE5抑制剂对低氧环境下U2OS细胞的生物钟周期、振幅、相移等主要特征的影响。结果显示,低氧会使细胞的振幅大幅下降（下降约87.5%）并引起细胞死亡,PDE5抑制剂可恢复细胞的生物钟振幅,并延迟死亡时间,但无法阻止细胞死亡。5、分子机制方面利用qPCR方法检测低氧条件下,PDE5抑制剂对细胞生物钟基因的影响,结果显示低氧可显著性增加生物钟负调节因子PER1、PER2、CRY1、CRY2的表达,而PDE5抑制剂能够显著降低这些基因的表达。6、通过模拟高原低氧环境（海拔6000m）,对小鼠进行8小时的低氧暴露（ZT0-ZT8）,qPCR结果显示,低氧8小时后,小鼠肝组织生物钟基因Per1、Per2的表达显著性增高,小鼠肺组织生物钟基因Cry1高表达,Per1、Per2、Cry2、Rev-erbα低表达。7、对小鼠进行8小时低氧给药实验,根据早晚内源性cGMP生成的差异,分为两种模型:白天给药后低氧8小时（ZT6-ZT14）和夜晚给药后低氧8小时（ZT18-ZT4）,实验结果显示,白天给药后低氧8小时,低氧可使肝脏Cry2的m RNA表达水平增高,PDE5抑制剂能显著性降低Cry2的m RNA表达。而夜晚8小时低氧给药后,低氧可使肝脏Per1、Cry2基因表达升高,Cry1的表达降低,PDE5抑制剂可使Per1的表达被显著降低（与低氧组比较）,Cry2有降低的趋势而未出现差异。研究结论:针对以上实验结果,我们得出以下结论:1、常氧条件下,PDE5抑制剂通过上调生物钟调节环路中的正调节因子并下调负调节因子,促进昼夜节律的相位前移,且TF比西地那非起效更快。2、PDE5抑制剂可以通过作用于生物钟基因改善低氧导致的昼夜节律振幅降低并延迟细胞死亡。3、动物水平进行8小时低氧暴露对小鼠生物钟基因的影响具有组织特异性和时间特异性。PDE5抑制剂可通过降低肝脏负调节因子Per和Cry的表达,调控低氧条件下生物钟变化。以上结论提示我们,PDE5抑制剂在常氧条件下能够促进昼夜节律相位前移,在低氧条件下能对低氧所致昼夜节律紊乱产生调节作用,针对当下市场及军队对调节昼夜节律紊乱药物的特殊需要,TF作为我国自主研发的低毒性1.1类新药,在昼夜节律紊乱防治方面具有良好的开发前景。