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第一部分OPG在NAFLD动物模型和病人中的表达目的:探索OPG在NAFLD动物模型和NAFLD病人中的变化,初步了解OPG与NAFLD之间的关系。方法:采用定量PCR法检测c57普食喂养雄性小鼠(20周龄)、HFD小鼠(8周龄开始喂养高脂12周)、ob/ob(普食喂养,20周龄)、db/db(普食喂养,20周龄)、脂联素基因敲除小鼠,NAFLD病人肝脏中OPG m RNA的表达情况。通过western blot方法检测c57、HFD、ob/ob、db/db,NAFLD病人肝脏中OPG蛋白表达情况。免疫组化分析NAFLD病人和正常人肝脏中OPG蛋白的表达。利用不同浓度的葡萄糖和FFAs刺激L02细胞后,测定OPG m RNA的变化。应用定量PCR方法测定不同喂养状态下c57小鼠肝脏中OPG m RNA的表达。结果:在NAFLD动物模型和NAFLD病人中,OPG m RNA和蛋白含量均显著降低(P<0.05),葡萄糖可以呈剂量依赖性的刺激OPG m RNA的表达,而FFAs则抑制OPG m RNA的表达。在空腹时,OPG m RNA表达升高,再喂养后OPG m RNA表达降低。结论:OPG与NAFLD的发生发展密切相关。第二部分体外改变OPG表达影响肝细胞甘油三酯的含量目的:体外证实OPG对肝细胞甘油三酯的影响。方法:通过构建OPG过表达或抑制腺病毒,感染L02细胞后,利用FFAs诱导肝细胞脂肪变性。通过油红O染色观察L02细胞脂滴变化情况,甘油三酯测定试剂盒测定肝细胞中TG的含量,PCR法测定甘油三酯代谢相关基因FATP2、FATP4、FATP5、CD36、SREBP1c、FAS、ACC、SCD-1、ch REBP、PPARα、Cpt-1a、Mcad、MTTP、LXR、PXR、RXR、PPARγ等m RNA的变化,western blot法测定甘油三酯代谢相关基因SREBP1c、ACC、FAS、CD36、PPARγ等蛋白的变化,western blot法筛选PKA、Akt、JNK、P38、ERK等信号通路的变化。结果:成功构建OPG过表达和抑制腺病毒。与对照组相比较,OPG过表达组肝细胞脂滴的数量及甘油三酯的含量显著升高(P<0.05);且脂肪酸摄取相关基因CD36显著升高,而脂肪酸合成相关基因SREBP1c、FAS、ACC、SCD-1,脂肪酸β氧化相关基因PPARα、Cpt-1a、Mcad,VLDL分泌相关基因MTTP等无明显变化。其次,OPG过表达组核受体基因PPARγ表达明显升高,而p-ERK的活性降低。然而,与对照组比较,OPG表达降低则会抵抗FFAs所诱导的肝细胞脂肪聚集,肝细胞中TG含量降低。脂肪酸摄取相关基因CD36显著降低,而脂肪酸合成相关基因SREBP1c、FAS、ACC、SCD-1,脂肪酸β氧化相关基因PPARα、Cpt-1a、Mcad,VLDL分泌相关基因MTTP等变化不明显。OPG抑制降低了核受体基因PPARγ的表达,增加了p-ERK的活性。结论:体外,OPG促进肝细胞甘油三酯聚集,这一过程可能与CD36和PPARγ的表达密切相关。第三部分OPG基因敲除小鼠抵抗高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性目的:通过研究OPG基因敲除小鼠,在体内明确OPG调控肝脏甘油三酯代谢的机制。方法:以杂合子与杂合子配种的方式大量繁殖OPG基因敲除小鼠,获得足够雄性野生型和纯合子小鼠后,在8周龄开始高脂喂养12周,分成WT-SD、OPG-/--SD、WT-HFD、OPG-/--HFD组。每周测定各组小鼠的体重、摄食等,在20周龄时行GTT、ITT等实验,通过眼球取血测定血清生化指标,取肝脏做组织病理切片,油红O染色观察肝脏脂滴多少,HE染色观察肝细胞脂肪变性情况,试剂盒测定肝脏甘油三酯等含量。提取肝脏组织RNA和蛋白做基因表达检测,PCR法测定甘油三酯代谢相关基因FATP2、FATP4、FATP5、CD36、SREBP1c、FAS、ACC、SCD-1、ch REBP、PPARα、Cpt-1a、Mcad、MTTP、LXR、RXR、PXR、FXR、PPARγ等m RNA的变化,western blot法测定甘油三酯代谢相关基因PPARγ、CD36、p-ERK等蛋白的变化。结果:OPG基因敲除小鼠体重明显低于WT小鼠,而摄食无明显变化。GTT、ITT实验显示OPG基因敲除小鼠能抵抗高脂诱导的胰岛素抵抗。血清学检测显示,高脂喂养之后,AST、ALT、TG、TC、FFA、GLU等明显升高,而OPG基因敲除组则低于WT对照组(P<0.05)。肝脏组织切片显示高脂喂养后,小鼠肝脏中脂滴明显增多,HE染色结果显示小鼠肝脏发生明显脂肪变性、空泡显著增多,但是OPG-/--HFD明显好于WT-HFD组。OPG-/-组肝脏甘油三酯含量低于WT组。OPG基因敲除组肝细胞脂肪酸摄取相关基因CD36、FATP2、FATP5表达明显降低,而脂肪酸合成相关基因SREBP1c、FAS、ACC、SCD-1,脂肪酸β氧化相关基因PPARα、Cpt-1a、Mcad,VLDL分泌相关基因MTTP等无明显变化。OPG-/-组小鼠肝脏PPARγ表达降低,而p-ERK活性增强。结论:体内,OPG基因敲除小鼠能够明显抵抗高脂饮食喂养诱导的肝脏脂肪变性,可能与脂肪酸摄取相关基因的表达变化密切相关。第四部分OPG调控甘油三酯代谢的机制目的:探索OPG调控肝脏甘油三酯代谢的分子机制。方法:首先利用原代肝细胞分离术,验证OPG过表达对c57原代肝细胞中TG及脂肪酸摄取相关基因CD36,核受体基因PPARγ,p-ERK等的影响。然后分离培养OPG-/-小鼠原代肝细胞,分析其与WT对照组中肝细胞内TG含量及脂肪酸摄取相关基因CD36,核受体基因PPARγ,p-ERK等的影响。进一步,利用CD36-/-原代肝细胞培养,验证OPG是否通过CD36来调控肝细胞中TG的含量。最后通过使用PPARγ抑制剂GW9662、ERK抑制剂SCH772984验证OPG是否通过p-ERK、PPARγ调控CD36的表达。结果:c57原代肝细胞经OPG-Fc处理之后,细胞内TG含量增多,脂肪酸摄取基因CD36表达增加,核受体基因PPARγ表达升高,而p-ERK活性降低。OPG-/-原代肝细胞较WT对照组,细胞内TG减少,脂肪酸摄取基因CD36表达降低,核受体基因PPARγ表达下降,而p-ERK活性增强。在CD36-/-原代中,OPG-Fc则不能增加细胞内TG含量。应用PPARγ抑制剂GW9662后,OPG-Fc不能增加CD36的表达。预先处理ERK抑制剂SCH772984后,OPG-Fc不能增加PPARγ、CD36的表达。结论:OPG通过ERK-PPARγ-CD36轴调控肝脏甘油三酯的含量。