杨树是世界上种植面积最为广泛的经济林木之一,它不仅被广泛应用于经济、生态和环境保护等领域，而且作为模式树种应用于木本植物遗传转化和分子机制研究。杨树作为重要的速生树种，是木材的主要来源。木材的主要成分包括木质素(Lignin)、纤维素(Cellulose)和半纤维素(Hemicellulose)，其中木质素是影响木材材性关键的成分之一。然而杨树中木质素生物合成机制尚不完全清楚。因此，阐明杨树中木质素合成的分子调控机制具有重要的意义。
　　MicroRNA(miRNAs)是一种内源单链非编码小RNA，长度约为20-22个核苷酸，能够靶向调控目标基因的表达。大量研究表明，miRNAs在调控植物生长和发育过程中发挥着重要的作用。此外，miRNAs还能够调控细胞壁主要组分，如糖和木质素的生物合成。已有研究证实，miR828在柑橘粒化过程中调控木质素的生物合成，在红薯伤害处理下调控木质素和H2O2的积累。目前尚未报道miR828在杨树木材发育过程中是否参与木质素的生物合成调控。因此，本研究拟阐明miR828在杨树中木质素生物合成过程中的生物学功能。
　　具体研究结果如下:
　　(1 )根据生物信息学分析，杨树中miR828有两个家族成员，分别是miR828a和miR828b。miR828a和miR828b的前体序列和成熟序列均完全相同，因此，挑选miR828a作为代表进行了研究。miR828a由156nt组成，定位于杨树染色体编号CM000348.2的非编码区。根据RNA结构分析网站，miR828a的二级结构具有一个典型的茎环结构,它最小的自由能为?57.3千卡/摩尔，其成熟序列位于茎环结构的5?末端区域。
　　(2)通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对miR828a的组织表达特异性进行分析，结果显示，其在杨树的根、茎基部的木质部和韧皮部均有特异性表达，说明miR828a可能参与杨树次生维管组织生长发育的调控。为分析miR828a的表达模式，克隆了毛白杨(Populus tomentosa)miR828a前体序列上游约1576bp的启动子片段，与GUS报告基因融合。通过根癌农杆菌(Agrobactium tumefaciens)转化杨树植株，对得到的转基因植株进行GUS染色分析，结果显示，miR828a在根、茎和叶柄等维管组织中均有表达。这些结果暗示miR828a可能参与了杨树次生壁的生物合成。
　　(3 )为了研究miR828a的生物学功能，构建了miR828a的过表达(miR828a-OE)和敲降(miR828a-KD)载体，转化杨树植物。在转基因植株中,miR828a过表达显著降低转基因植株高度和茎粗，miR828a-KD敲降的转基因植物中则表现出相反的表型。此外，还观察到miR828a-KD植株中出现了木质素和半纤维素的异位沉积。对茎组织中细胞壁各组分进行测定，结果显示，与野生型相比，miR828a-OE植株中木质素含量降低，miR828a-KD转基因植株中则木质素含量增加。但miR828a过表达和敲降对木聚糖含量无显著影响，葡聚糖的含量有变化。上述结果表明，miR828a负调控杨树的生长发育和木质素的生物合成。
　　(4)为鉴定miR828a的直接靶基因，在全基因组水平上将miR828a成熟序列与杨树基因组序列进行查找和比对，筛选出能够被miR828a识别的19个靶基因，其中7个为MYB类基因，其中MYB011、MYB129、MYB171这三个靶基因预测值较高。组织表达分析显示，MYB011和MYB129与miR828a表达模式存在相反的趋势，其中MYB011的表达水平明显高于PtrMYB129，因此，推测MYB011可能是miR828a关键的靶标基因。
　　(5 )为了验证MYB011是否miR828a的靶基因，qRT-PCR结果显示,MYB011在miR828-OE植株中表达水平显著下调，在miR828a-KD植株中表达则上调。降解组实验证实，MYB011的mRNA在miR828a结合位点被切割。为进一步验证MYB011的功能，构建了一个CaMV35S启动子控制的MYB011过表达(MYB011-OE)载体，转化杨树，发现MYB011-OE转基因植株高度增加，木质部次生壁厚增加，侧枝增多。此外，还观察到MYB011-OE转基因植株木质化程度增加。
　　综上所述，本论文克隆了一个杨树miRNA——miR828a,通过转基因技术及生化方法证明了miR828a通过负调控靶基因MYB011的表达，降低了杨树茎中降低了杨树茎中木质素的含量，导致其株高、茎粗和木质部细胞壁厚度均下调。本研究可为将来改良杨树木材材性、提高木材品质的分子育种提供新的策略。