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研究背景及目的:炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是结肠的一种慢性炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）和克罗恩病（Chron’sdisease,CD）。炎症性肠病的病因尚不完全清楚,可能与患者的遗传易感性、环境、肠道菌群和免疫系统之间复杂的相互作用有关。研究表明巨噬细胞是炎症性肠病的关键参与者。在IBD患者的肠道炎性反应中,巨噬细胞的数量明显增加,并释放白细胞介素、肿瘤坏死因子等多种生物活性物质。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是机体固有免疫的关键。TLRs信号的过度激活与IBD的发生相关,因此抑制TLRs信号的过度激活显得尤为重要。TAM受体（TAM-receptor）是受体酪氨酸激酶中的亚家族,它由Tyro3、Axl和Mertk组成,是TLRs信号通路的负调节因子之一,具有包括免疫调控在内的多种生物学功能。课题组前期研究发现,TAM受体的配体Gas6可以抑制LPS刺激后巨噬细胞内TLR4信号通路的激活和促炎细胞因子的分泌。但TAM受体在这一过程是如何调控的尚不清楚。因此,本文对TAM受体在炎症性肠病和巨噬细胞中的调控作用及其机制进行了初步探讨。方法:一、TAM受体信号和TLRs信号通路在IBD中的变化1.IBD患者肠黏膜内TAM受体和配体Gas6的变化（1）实验分组:（1）正常患者（n=19）（2）炎症性肠病患者（n=19）（2）各组指标检测:免疫组化法检测各组患者肠黏膜TAM（Tyro3、Axl、Mertk）和Gas6蛋白的表达。2.小鼠实验性结肠炎模型中TAM受体和TLRs信号通路的变化（1）实验分组:20只清洁级68周龄的Balb/c鼠随机分成以下2组（1）正常对照组（n=10）（2）DSS模型组（n=10）（2）实验性结肠炎模型的建立:DSS诱导小鼠实验性结肠炎模型的建立:68周龄的Balb/c小鼠自由饮用5%DSS溶液7天,于第8天处死小鼠（此过程已由课题组前期完成）。（3）各组指标检测:（1）荧光定量PCR检测各组肠黏膜内TAM（Tyro3、Axl、Mertk）、TLR2、TLR4和MyD88 mRNA的表达（2）Wes全自动蛋白分析检测各组肠黏膜内TAM（Tyro3、Axl、Mertk）、TLR2、TLR4、MyD88和pNF-κB p65蛋白的表达二、TAM受体对巨噬细胞中TLRs信号通路的调控1.实验分组:（1）空白组:（1）野生型RAW264.7（2）AxlLowRAW264.7（3）Tyro3HighRAW264.7（4）MertkHighRAW264.7（3）LPS刺激组:（1）野生型RAW264.7+LPS（2）AxlLowRAW264.7+LPS（3）Tyro3HighRAW264.7+LPS（4）MertkHighRAW264.7+LPS（4）LPS刺激和Gas6处理组:（1）野生型RAW264.7+LPS+Gas6（2）AxlLowRAW264.7细胞+LPS+Gas62.Tyro3、Axl、Mertk敲减细胞株和过表达稳转巨噬细胞株的构建:通过转染上海吉凯基因公司构建的慢病毒载体,经嘌呤霉素药筛后,扩增转染后的巨噬细胞株,构建Axl敲减细胞株,并且筛选出两个有效敲减靶点,以及Tyro3和Mertk过表达稳转株。3.各组指标检测:（1）荧光定量PCR检测各组细胞内TLR2、TLR4和MyD88 mRNA的表达。（2）Wes全自动蛋白分析检测各组细胞内TLR4、MyD88和pNF-κB p65蛋白的表达。结果:一、TAM受体和TLRs信号通路在IBD中的变化1.IBD患者肠黏膜内TAM受体和配体Gas6的表达IHC结果显示:IBD患者肠粘膜组织中,阳性细胞数明显低于正常对照组,TAM（Tyro3、Axl、Mertk）和Gas6蛋白表达均显著低于正常对照组（P<0.001）。2.DSS诱导的实验性结肠炎小鼠结肠组织中TAM受体、TLRs信号通路相关分子的表达RT-PCR结果显示:与对照组相比,DSS诱导的实验性结肠炎小鼠结肠组织中Axl、Tyro3和Mertk mRNA表达均下降,有显著差异（P<0.01,P<0.01,P<0.05）;在TLRs信号通路相关分子中,TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达均升高,显著高于正常对照组（P<0.001,P<0.01,P<0.05）。Wes蛋白结果显示:DSS诱导的实验性结肠炎小鼠结肠组织中Tyro3、Axl和Mertk蛋白与正常对照组相比表达下降,且显著低于正常对照组（P<0.001）。二、TAM受体对巨噬细胞TLRs信号通路的影响1.Tyro3、Axl、Mertk敲减细胞株和过表达稳转巨噬细胞株的构建和验证成功筛选出敲减细胞株和过表达稳转细胞株,并通过倒置荧光显微镜观察细胞转染效率达90%以上。通过RT-PCR和Wes TM蛋白分析检测转染细胞mRNA和蛋白表达情况,证实Tyro3、Axl、Mertk敲减细胞株和过表达稳转巨噬细胞株构建成功。2.Axl对巨噬细胞TLRs信号通路的影响（1）敲减AXL巨噬细胞中TLRs信号通路的影响AxlLowRAW264.7与WT-RAW264.7比较,在mRNA水平,TLR2的表达显著升高（P<0.01）,TLR4和MyD88mRNA的表达也升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;在蛋白水平,pNF-κB p65表达显著升高（P<0.05）,TLR4和MyD88蛋白的表达也升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。LPS刺激后,AxlLowow RAW264.7与WT-RAW264.7比较,在mRNA水平,TLR2和TLR4 mRNA表达显著升高（P<0.01）,MyD88 mRNA表达也升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;在蛋白水平,pNF-κB p65蛋白表达显著升高（P<0.01）,TLR4和MyD88蛋白表达也升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。（2）Gas6对AXL敲减巨噬细胞中TLRs信号通路的影响LPS刺激AxlLowow RAW264.7后,TLR2和MyD88 mRNA表达显著高于无LPS刺激组（P<0.001）,TLR4的mRNA表达也高于无LPS刺激组,但差异无统计学意义（P>0.05）;TLR4和MyD88蛋白表达显著高于未加LPS刺激组（P<0.01,P<0.001）,pNF-κB p65蛋白的表达也升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。同时给LPS和Gas6处理后TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表达都显著下降并低于未加Gas6处理组（P<0.001）;TLR4、MyD88和pNF-κB p65蛋白表达都显著下降并低于未加Gas6处理组（P<0.001）。3.Tyro3对巨噬细胞TLRs信号通路的影响Tyro3HighRAW264.7与WT-RAW264.7比较,在mRNA水平,TLR2表达显著下降（P<0.01）,TLR4和MyD88表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;在蛋白水平,MyD88和pNF-κB p65表达显著下降（P<0.05）,TLR4的表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。在LPS刺激后,Tyro3HighRAW264.7与WT-RAW264.7比较,在mRNA水平,TLR4表达显著下降（P<0.01）,TLR2和MyD88表达也下降,但差异无统计学意义（P>0.05）;在蛋白水平,TLR4和MyD88表达显著下降（P<0.001,P<0.05）,pNF-κB p65的表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。4.Mertk对巨噬细胞TLRs信号通路的影响MertkHighigh RAW264.7与WT-RAW264.7比较,在mRNA水平,TLR2和MyD88表达显著下降（P<0.01,P<0.05）,TLR4表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;在蛋白水平,TLR4和MyD88表达显著下降（P<0.01,P<0.05）,pNF-κB p65的表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。在LPS刺激后,Mertk Highigh RAW264.7与WT-RAW264.7比较,在mRNA水平,TLR4和MyD88表达显著下降（P<0.01,P<0.05）,TLR2表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;在蛋白水平,TLR4和MyD88表达显著下降（P<0.01,P<0.05）,pNF-κB p65的表达也降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.IBD患者和DSS诱导的实验性结肠炎小鼠肠黏膜中TLRs信号过度激活,可能与其负性调控因子TAM（Tyro3、Axl、Mertk）/Gas6信号被抑制有关。2.TAM受体可以抑制LPS刺激后巨噬细胞内TLRs信号通路的激活,其途径可能涉及MyD88依赖和非依赖双重途径。3.在巨噬细胞中Gas6除了通过Axl外,可能还通过Tyro3和Mertk或非TAM途径负性调控TLRs信号通路。