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目的建立基于TaqMan探针的实时定量逆转录PCR检测与定量轮状病毒G4型VP7基因的方法。方法轮状病毒(Rotavirus, RV)是5岁以下儿童重症腹泻最主要的病原体,其感染引起的死亡占儿童死亡数的5%,其中90%发生在发展中国家。WHO推荐所有国家的免疫程序中应当包含轮状病毒疫苗,以预防轮状病毒感染。实时定量PCR (Polymerase chain reaction)可连续收集一只或多只PCR管中每个循环的荧光信号,该信号与模板的拷贝数相关。一个完美的定量PCR其斜率为3.32,对应的扩增效率为100%,截距在33到37个循环之间且R2为1.00。本试验目的是建立一种基于TaqMan(?)探针的快速、准确、特异的RV荧光定量逆转录PCR方法,用于RV G4型VP7基因的检测及定量。使用RT-PCR (Reverse transcription PCR)以轮状病毒G4型VP7基因为模板设计引物和探针,探针5’端距离上游引物3’端8bp,使用JOE标记探针3’端报告基团,5’端标记Eclipe淬灭基团。从轮状病毒G4型中扩增出VP7基因,将该基因构建于质粒并克隆培养。从质粒中扩增并纯化的VP7 DNA为模板,体外转录RNA。将该RNA纯化并使用光度法定量,稀释RNA至102-107拷贝／μl数量级作为RT-qPCR (Real time quantitative PCR)标准品,优化PCR体系,通过绝对定量法测定样品中G4型病毒RNA拷贝数。结果所获得的RNA标准品纯度高,可以用于G4型轮状病毒的检测和定量。建立的扩增体系具有宽广的动态范围,扩增效率大于90%,所构建标准曲线R2大于0.98；相比普通的RT-PCR方法,定量PCR灵敏度提高了约一个数量级,可轻易自100拷贝／μl数量级样本中检出目的基因,试验重复性好,特异、灵敏。结论基于TaqMan(?)探针的RT-qPCR可以特异、灵敏的检测和定量细胞培养物中的轮状病毒G4型VP7基因。