目的:肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤。放射治疗是肺癌综合治疗的重要手段之一。如何及时、准确评估放疗疗效,对肺癌个体化治疗策略的制定具有重要意义。传统影像学检查很难区分活性的肿瘤组织与放疗后的纤维化及肿瘤内部出血及囊变,也不能对微小残留病灶作出反应,很难在早期反应肿瘤治疗效果。肿瘤生物标记物因敏感性和特异性较低在评估疗效方面价值有限。作为液体活检的三大手段之一,循环肿瘤DNA包含肿瘤细胞的全部基因突变信息,具有克服组织活检肿瘤异质性缺陷、实时监测、可高频监测等优势,通过外周血循环肿瘤DNA检测可以对肿瘤患者放疗敏感性及肿瘤突变负荷进行监测,同时可对肿瘤驱动基因及高频基因进行筛查和分析。本研究拟通过检测非小细胞肺癌患者外周血中循环肿瘤DNA突变特征及基因谱,初步探索其与放射治疗敏感的相关性。方法:前瞻性纳入2017年-2019年在四川省肿瘤医院初治,有可评估原发病灶,需行放疗的部分非小细胞肺癌患者。采集清晨空腹肘静脉血10ml,4℃度5000rpm离心10min,收集上清液用于富集血清循环肿瘤DNA。采用Agilent Sure Select Human All Exon V6试剂盒分离循环肿瘤DNA,制备DNA文库,将特异性的index文库与有参标记的探针进行液相杂交,链霉素磁珠捕获外显子,经PCR线性扩增后行文库质检合格后,进行Illumina Hi Seq PE150测序,比对人参考基因组,检测变异信息,获得突变特征谱,并筛查肿瘤驱动基因及高频基因谱。同时评估患者放射治疗前后肿瘤体积缩退率,再进行放疗剂量的归一化处理,获得生物等效缩退率(肿瘤退缩率/生物等效剂量)。进一步将突变特征及基因谱与生物等效缩退率进行相关性分析。结果:1.临床入组情况:总计35例患者入组,其中因多种原因在治疗前选择放弃治疗的有7例,于治疗当中放弃治疗而未完成放疗计划的有5例,最后完成全部放疗计划的患者总计23例,其中1例在治疗过程中出现肺部严重感染,胸腔积液,放疗被迫中断,待感染控制后断续完成放射治疗,总放疗持续时间>8周,另2例在放疗开始前1周内完成了铂类为基础的双药联合化疗。所有患者均在纳入研究前签署知情同意书,为了避免铂类化疗药物对肿瘤突变负荷,基因编码和潜在驱动突变的影响,合并严重感染放疗中断时间过长对肿瘤退缩的影响,我们在进行疗效分析时,筛除2例接受化疗的样本和1例放疗中断时间过长的样本,对剩下的20例样本进行分析,分别计算各样本的肿瘤等效退缩率,间接评估肿瘤对放射治疗的敏感性。2.突变总体特征:测序结果显示外周血循环肿瘤DNA突变特征主要有单核苷酸突变、小片段插入/缺失突变、拷贝数变异三种类型。而单核苷酸突变中以外显子编码区域错义突变为主,约占70%,而同义突变约占25%左右,由于插入、删除或连续碱基替换导致变异位点处产生一个新的终止密码子或终止密码子丢失的非同义突变及未知突变仅占约5%。除外显子区域突变外,另有部分内含子区及基因间隔区突变;而UTR区域、非编码RNA区域及剪切位点周围4b P区域突变相对较少。基因小片段的插入/缺失非常少见,主要表现为外显子编码区域移码/或非移码插入/或缺失,另见部分内含子区域突变,其他突变则很罕见。拷贝数变异则分为重复和缺失两种类型,每一类型又有区域大小及数目多少之分。测序结果显示拷贝数变异的两种类型均有表现,且重复和缺失多发生在同一样本的不同位点上,但变异数目的多少与区域的大小无绝对正相关性。从整体评估肿瘤突变负荷的高低,发现随着放射治疗的进行,肿瘤突变负荷也出现或增高或降低的变化。另外,对肿瘤基因表达谱进行筛查发现6个易感基因,15个驱动基因及16个高频基因,同时对全部基因进行突变频谱及突变特征分析,发现点突变都以C>T/G>A为主,进一步行杂合性缺失分析、基因相关性分析、通路富集分析及高频CNV分析等。3.放疗敏感性分析:20例样本中,肿瘤等效退缩率敏感界值(30%/生物等效剂量均值)为0.43%,最低为-0.19%(其中负代表肿瘤进展),最高为1.52%,将样本分成敏感组和抵抗组,分别观察两组样本的基因突变特征,并分析放射敏感性,发现单核苷酸突变总数、非同义突变数、非编码RNA突变数、UTR区域突变数、剪切位点4bp区域突变数、肿瘤突变负荷、基因拷贝数变异类型及数目在敏感组和抵抗组并无统计学差异,但基因拷贝数变异总区域大小,尤其时拷贝数重复区域大小在敏感组和抵抗组具有统计学差异(P<0.05),且呈负相关性。同时也将筛查的易感基因、驱动基因及高频基因进行放射敏感性分析,发现这些基因在敏感组和抵抗组的表达并无统计学差异。结论:1.循环肿瘤DNA突变特征主要表现为外显子编码区错义突变,基因拷贝数变异也是另一个重要突变特征,小片段插入/缺失很少见;2.单核苷酸突变总数、错义突变数、非同义突变数、非编码RNA突变数、UTR区域突变数、剪切位点4bp区域突变数及肿瘤突变负荷数均与放射治疗敏感无关;筛查到的肿瘤已知驱动基因及高频基因均未显示出与放射治疗的相关性;基因拷贝数变异区域大小,尤其是重复区域的大小与肿瘤放射敏感呈现出负相关性,即拷贝数重复区域越大,放射治疗敏感性越低。