研究背景临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术和美容需求等各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形修复外科面临的最常见问题。为解决上述问题,胶原注射剂、真皮移植、人工合成材料以及游离脂肪组织移植都被广泛应用于临床工作中。目前临床上常用的软组织缺损修复填充剂有许多种,如胶原蛋白、透明质酸、聚丙烯酰胺水凝胶、聚乳酸等,是异体人工材料填充修复,由于填充材料不能成为人体组织的一部分,可出现移植的排斥反应,而且容易感染及移位穿破皮肤,极大的限制其使用。作为能够完全为人体所接受,不产生排异反应,并能够大量获得的组织填充材料,没有一种能够和人体自身的脂肪组织相媲美,人体自身的脂肪组织是质优价廉的材料。自体脂肪组织是理论上最理想的的软组织填充材料来源。自Neuber于1893年率先用自体脂肪移植治疗软组织缺损至今已有一百多年历史,然而,脂肪移植物的低存活率及其体积存留的不可预知性,限制了其临床应用。在脂肪移植后的组织形态变化方面许多学者都进行了相关研究。一般认为：单纯颗粒脂肪组织注射移植后,脂肪组织只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应,而这种供应的距离是极为有限的,只有150-200微米。超过该距离就需要生成新的血管来提供营,然而这种自发的血管生成速度非常缓慢,每天只生长十几微米。宿主的新生血管长入移植物一般要在移植后5天并且只能侵入移植物的周边部位,Peer发现,脂肪游离移植后其所含脂肪细胞耐受缺血的最长期限是4天。血供的延迟性以及血供重建主要位于移植脂肪外周部,移植脂肪中心长期处于缺血状态,中央部分的脂肪组织由于缺血缺氧时间过长,发生了坏死、液化,继而被巨噬细胞清除,发生纤维囊性变,微囊的出现预示着移植体最终纤维化和吸收。越来越多的研究逐渐达成了共识,在自体颗粒脂肪移植后的转归过程中,移植早期建立充分和及时的血供,移植物及时地再血管化是影响其成活体积的关键,也是减少其纤维囊性变的关键。近年来随着人们对干细胞研究的不断深入,利用于细胞移植疗法来促进移植物的再血管化,展示了干细胞在脂肪移植应用中的美好前景。2007年Yoshimura等报导了将基质血管成分细胞(SVF)辅助脂肪移植应用于隆胸手术,取得了良好的效果。SVF是一个脂肪来源干细胞与血管内皮细胞、外周血细胞、T细胞及其他炎症细胞相混杂的群体,在体内环境下能够分化为成熟脂肪细胞,促进宿主干细胞向受区的定向迁移,部分参与了构成新生血管内皮细胞,有助于移植脂肪组织早期血供的建立。我们前期动物研究发现,SVF辅助兔脂肪移植于兔腰背部,能显著提高移植脂肪的存活率,减少移植物的纤维化并改善了移植物的质地。应用自体SVF细胞辅助脂肪移植,手术可一期完成,且无需体外培养,安全性高,更易于临床推广。研究目的1.改良传统实验方法,优化技术参数,研究在较短时间内获得较大量SVF细胞的技术方法；探讨密度梯度离心法应用于纯化SVF细胞的可行性。2.SVF辅助自体脂肪移植在面部软组织填充的有效性及安全性的临床对照研究。3.SVF辅助自体脂肪移植隆乳术的有效性及安全性的临床对照研究。材料与方法1.浓度、消化时间、离心力参数对获取SVF数量的影响收集抽脂术患者的脂肪组织,在固定其它因素不变的前提下,依次在不同水平改变消化浓度、消化时间、离心力大小,获取细胞沉淀,完全培养液重悬细胞。加入红细胞裂解液,过滤获得SVF细胞。细胞计数板计数细胞总量。用MTT法绘制细胞增殖生长曲线。2.密度梯度离心法纯化SVF细胞以Ficoll液(1.083g/ml)为密度梯度介质。将分离获得的SVF细胞混悬液加入到放有10mlFicoll液的15ml离心管中。将配好的液体置入离心机,离心(1000g、20min)细胞计数板分别计数上层混悬液及底部混悬液中SVF细胞数目,计算底部沉淀中SVF占总数的百分率(%)=(底部SVF数/总SVF细胞数)×1003. SVF辅助脂肪移植应用于面部软组织充填实验组(SVF辅助组)26例,对照组(单独脂肪移植组)12例,脂肪供区为大腿或腹部皮下。采用局部肿胀麻醉结合基础麻醉方式常规抽吸获取供区皮下脂肪。将处理好的脂肪一半用于移植,另一半用于提取SVF细胞。用Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心、红细胞裂解液裂解,获取SVF细胞。SVF细胞均保留样本进行细菌培养+药敏试验。将SVF细胞混悬液与待移植脂肪混匀、静置后注入面部凹陷区域。患者术前及术后6月均进行了数码照相、头颅CT检查,CT扫描图片采用Philips Extended Brilliance Workspace系统进行脂肪定量分析,比较两组间脂肪存活率的差异。4. SVF辅助脂肪移植应用于隆乳术实验组(SVF辅助组8例,对照组(单独脂肪移植组5例,脂肪供区为大腿或腹部皮下。采用局部肿胀麻醉结合基础麻醉方式常规抽吸获取供区皮下脂肪。将处理好的脂肪一半用于移植,另一半用于提取SVF细胞。用Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心、红细胞裂解液裂解,获取SVF细胞。SVF细胞均保留样本进行细菌培养+药敏试验。将SVF细胞混悬液与待移植脂肪混匀、静置后注入胸部受区。患者术前及术后6月均进行了数码照相、乳腺钼靶摄影、胸部CT检查,CT扫描图片采用Philips Extended Brilliance Workspace系统进行脂肪定量分析,比较两组间脂肪存活率的差异。5.统计学分析所得数据均采用SPSS13.0软件包进行统计分析,根据方差是否齐性采用单因素方差分析或VVelch、组间多重比较用LSD法或Tamhane’s。另还采用析因分析,以均数±标准差(x±s)表示。P<0.05差异有统计学意义。结果1.0.10%浓度组SVF数量(0.72±0.12)×106,0.20%浓度组(0.95±0.16×106,0.25%浓度组(1.91±0.56)×106,0.40%浓度组(1.88±0.55)×106,0.50%浓度组(1.86±0.53)×106,经SPSS13.0软件随机设计资料均数间的多重比较进行统计学分析处理后,后三组(0.25%、0.40%、0.50%)与前两组(0.10%、0.20%)均数比较差异有显著性(P<0.05),后三组(0.25%、0.40%、0.50%)之间均数两两比较差异无显著性(P>0.05),前两组(0.10%、0.20%)之间均数两两比较差异有显著性(P<0.05)。说明在其它实验参数条件不变的前提下,胶原酶消化浓度大于等于0.25%时(0.25%、0.4%、0.5%),脂肪组织已充分消化,可以获得较高数量级的SVF细胞。2.10min消化组SVF数量(0.10±0.06)×106,20mmin消化组SVF数量(0.20±0.08)×106,30min消化组SVF数量(1.964±0.42)×106,40min消化组SVF数量(1.95±±0.35)×106,50min消化组SVF数量(1.90±±0.29)×106,经SPSS13.0软件随机设计资料均数间的多重比较进行统计学分析处理后,后三组(30min、40min、50min)与前两组(10min、20min)均数比较差异有显著性(P<0.05),后三组(30mmin、40mmin、50min)之间均数两两比较差异无显著性(P>0.05),前两组(10min、20mmin)之间均数两两比较差异有显著性(P<0.05)。说明在其它实验参数条件不变的前提下,胶原酶消化时间大于等于30mmin时(30min、40min、50mmin),脂肪组织已充分消化,可以获得较高数量级的SVF细胞,继续延长消化时间无法获得更多的SVF细胞。3.1000g组SVF数量(1.89±±0.50)×106,2000g组SVF数量(1.88±±0.55)×106,3000g组SVF数量(1.894±0.55)×106,经SPSS13.0软件随机设计资料均数间的多重比较进行统计学分析处理后,三组均数之间均数两两比较差异无显著性(P>0.05)。说明在其它实验参数条件不变的前提下,改变离心力大小对获取SVF数量无影响。4.梯度离心后吸取离心管上层液体再次离心获取细胞沉淀镜下观察及计数发现：大部分红细胞已去除,视野清晰,但仍可见SVF细胞中混杂有部分双凹圆饼状红细胞。红细胞裂解法获取的SVF细胞沉淀中几乎不可见红细胞。将离心管底部的细胞沉淀收集镜下观察及计数,可见细胞成分主要为红细胞及少量SVF细胞,底部沉淀中SVF占SVF总数的比率为(11.30±5.10)%。MTT法检测细胞增殖生长能力培养结果显示,两种实验方法之间OD值差异无显著性意义(P>0.05),可见细胞增殖并无明显差别。5.所有患者术后均呈现出程度不一的改善；SVF辅助移植组患者面型圆润、丰满,面部轮廓较术前明显改善。SVF样本细菌学培养结果均为阴性。部分患者术后一周内出现轻微肿胀、瘀斑,均自行消褪。未见明显手术疤痕,随访观察未发现感染、血肿、重要结构的损伤、脂肪包块等并发症。38例患者术前及术后6月头颅CT检查均未见明显异常,术前SVF辅助移植组脂肪注射量17.54±7.30ml,单独脂肪移植组脂肪注射量16.25±6.34ml；术后6月SVF组脂肪存活体积11.50±5.29ml,对照组脂肪存活体积7.56.26m；脂肪存活率(%)=术前脂肪注射量/术后脂肪存活体积×100。SVF组脂肪存活率(%)=64.82±10.23,对照组脂肪存活率(%)=46.41±9.34。经SPSS13.0软件独立样本的t检验进行分析,P<0.05,两组之间差异有显著性。SVF辅助移植组6月后脂肪存活率高于对照组。6.所有患者术后均呈现出程度不一的改善；增大的乳房柔软,胸部曲线较术前改善。SVF样本细菌学培养结果均为阴性。部分患者术后一周内出现轻微肿胀、瘀斑,可自行消褪。未见明显手术疤痕,术后随访6个月观察至今未发现感染、血肿、脂肪坏死及皮下硬结等并发症。13例患者术前及术后6个月乳房钼靶、胸部CT检查均未见明显异常,术前SVF辅助移植组脂肪注射量151.25±35.63(ml),单独脂肪移植组脂肪注射量124.00±18.17ml；术后6月SVF组脂肪存活体积94.68±24.62m1,对照组脂肪存活体积59.82±12.27ml；脂肪存活率(%)=术前脂肪注射量/术后脂肪存活体积×100。SVF组脂肪存活率(%)=63.06±10.47,对照组脂肪存活率(%)=47.95±4.20。经SPSS13.0软件独立样本的t检验进行分析,P<0.05,两组之间差异有显著性。SVF辅助移植组6月后脂肪存活率高于对照组。结论：1.使用浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶,消化时间为30分钟可获得较大量的SVF细胞；密度梯度离心可去除细胞沉淀中的大部分红细胞。2.SVF辅助脂肪移植应用于面部软组织填充与单纯脂肪移植比较,能够有效地提高脂肪存活率,获得了满意的临床疗效并且未发现远期并发症。3SVF辅助脂肪移植应用于隆胸术与单纯脂肪移植比较,能够有效地提高脂肪存活率,未发现远期并发症。大样本的长期对照随访研究对于评价这项技术的安全性和有效性是非常有必要的。