Akt／Fox01通路参与心肌细胞有丝分裂的相关研究前言传统观点认为成年心肌细胞终止分化，丧失有丝分裂能力，不能进入细胞周期，心肌肥厚是原有心肌细胞肥大及非心肌细胞的增生，并不存在心肌细胞增殖。然而近年来大量证据显示在心脏发育及病理过程中存在心肌细胞的凋亡和增殖两种过程，维持心脏功能的稳态平衡。据认为高度分化的哺乳动物细胞不能再增殖，这些细胞永久的退出细胞周期。细胞特异性的关键蛋白在细胞内积聚并驱使细胞到达最后的形态和功能。与哺乳动物相反，硬骨鱼和两栖动物的终末分化细胞可以去分化和（或）增殖，从而再生。例如，斑马鱼的心脏可以通过心肌细胞的增殖而再生。因此，对于调节心肌细胞周期退出机制的全面而彻底的理解，以及发展刺激哺乳动物心肌细胞增殖的方法，具有极大的潜在性治疗价值。细胞周期的进程受到严密调控，包括Cyclins和其催化分子Cyclin依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDKs）。其中CDK2是调控G₁／S转换的主要激酶，是决定细胞最终能否进入细胞周期的关键。其活动除了受正调控（如cyclin E和cyclin A）和负调控(如p21^Waf1／Cip1和p27^Kip1和p57^Kip2)机制控制外，还接受翻译后修饰的调节（如磷酸化）。抑制性激酶Weel，通过Tyr¹⁵位的磷酸化负调控CDK2的活性。推动细胞由G2末期进入M期主要直接动力来自于M相促进因子（Mphase promoting factor，MPF），Polo样激酶1（polo-like kinase 1，plk1）直接或间接磷酸化MPF而使其活化。蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB／Akt）属于丝／苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）下游的直接靶蛋白之一。在多种细胞中，Akt充当抗凋亡信号激酶的作用，此外，还在细胞存活、细胞增殖和葡萄糖代谢等活动中扮演着关键角色。近些年来，随着对Akt研究的深入，发现它同样参与细胞周期中G1期进程和G2／M期转换的调节。然而，Akt对心肌细胞增殖的调控目前还很少报道，而且互相矛盾。因此，心脏中PI3K或Akt激活是促进心肌细胞增殖还是诱导心肌细胞肥大尚无定论，而且存在很大争议。Fox0（Forkhead box，class 0）转录因子亚家族是PI 3k／Akt信号通路的直接下游底物，其中Fox01直接被Akt磷酸化后从胞核移位到胞质，使之停留在细胞质并降解而失去转录活性。Fox0参与许多靶基因的转录，这些基因涉及到了细胞周期的停滞、细胞静止和凋亡。据认为，Fox0在细胞的分化增殖和抑制中起多样性作用，是细胞分化增殖和抑制的开关。那么，Fox0在心肌细胞退出细胞周期的调控中是否也起着决定性的开关作用?值得进一步深入探讨。本研究以不同发育阶段和压力超负荷大鼠的心肌组织以及H9C2（2-1）大鼠心肌细胞系为实验对象，通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光双重染色等技术，检测Akt-Fox01通路及其下游靶基因plk1和weel的表达改变并探讨其对心肌细胞退出细胞周期的作用，同时，通过野生型Akt基因在H9C2（2-1）大鼠心肌细胞系中的过表达，探索Akt-Fox01通路对心肌细胞增殖的调控作用，为揭示心肌细胞退出细胞周期的调控机制提供重要依据。材料与方法1．材料与试剂中国医科大学实验动物部提供Wistar大鼠；H9C2（2-1）大鼠心肌细胞株购自中国科学院上海细胞所；Anti-磷酸化组蛋白H3（phosph-Histone H3，H3P）IgG单克隆抗体为美国Cell Signalling公司产品，anti-Plk-N19（Goat）多克隆抗体、FITC标记二抗和ECL化学发光试剂为美国Santa Cruz公司进口分装，anti-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin，α-SMA）IgM单克隆抗体和Cy3-SABC-IgM免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。TRIzol购自美国Ivitrogen公司，TaKaRa RNA LA PCR^TM Kit（AMY）Ver. 1. 1和100bp DNALadder Marker（650ng DNA／5μl）购自大连宝生物公司，GeneFinder^TM购自厦门百维信生物技术有限公司，DEPC（high pure）购自美国Sigma公司，预染蛋白分子量Marker（20KDa-120KDa）为美国Fermentas Life Sciences公司产品，硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，anti-β-Tubulin（mouse）单克隆抗体购自华特生生物技术公司，HRP-IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装。真核表达载体pCIS2-Akt-WT，由Michael J. Quon教授（National Institutes of Health）惠赠。质粒pGPU6-GFP和菌株DH5α购自上海吉玛制药技术有限公司。2．取材所有手术器械高压灭菌，器皿和耗材用0.1％DEPC水浸泡过夜，将大鼠用0.4％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，立即开胸取心，放入冷PBS中冲洗残余血液，切取100mg左心室心肌组织放入1.5mlEP中，再加入0.1mlRNALocker，4℃保存，用于RNA提取；切取0.5cm×0.5cm的左心室心肌组织于1.5mlEP中，-70℃保存，用于蛋白提取；切取0.3cm×0.3cm的左心室心肌组织，OCT包埋，液氮速冻，用于冰冻切片制备。3．升主动脉缩窄动物模型制作将雌性Wistar大鼠称重后，戊巴比妥钠40mg／kg腹腔麻醉。于颈部正中行气管切开后，插入气管插管，接小动物呼吸机，右前胸水平切口开胸，暴露并分离升主动脉，在主动脉瓣上方约0.5cm处，用穿有1号丝线的无菌聚乙烯塑料管结扎。假手术组同期开胸分离升主动脉，但不进行结扎。术后8周采用高频多普勒超声检查心肌肥大情况。4．心肌组织免疫荧光双重染色：将冰冻切片空气干燥后，用4％多聚甲醛或冷丙酮固定30min，PBS洗10min，5％BSA-PBS液封闭1h，一抗（α-SMA小鼠IgM单克隆抗体1：100，H3P小鼠IgG单克隆抗体1：100，或laminin单克隆抗体1：100）4℃孵育过夜，PBS洗10min×3，二抗（Cy3-SABC小鼠IgM1：100，FITC小鼠IgG1：100）室温暗盒孵育2h，PBS洗10min×3，Hoechst33342染5min，缓冲甘油封片，Olympus荧光显微镜观察并拍照。5．RT—PCR取上述冻存的心肌组织各100mg分别加1mlTRizol，按照操作说明提取总RNA，全部样本的OD_260／280。比值在1.8-2.0之间。根据TaKaRa RNA LA PCR^TM Kit （AMV）Ver. 1.1试剂盒操作说明进行逆转录和扩增。plk1基因（Genebank NM₀17100.1）引物应用软件Primer5.0自行设计，经Blast验证评分较高。Akt、Fox01和内参照GAPDH引物参考相应文献。取5μl扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，GDS凝胶成像分析系统进行光密度分析并摄像。以待测基因与相应GAPDH光密度比值作为产物的相对表达含量。6．Western Blotting取出-70℃保存的心肌组织，加入1ml RIPA裂解液，提取总蛋白，并测定蛋白浓度。电泳前，加入样品缓冲液，100℃煮沸5min，离心后上样，12％SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉的封闭液将滤膜于室温缓慢摇动温育1h进行封闭，封闭后的滤膜再与抗体（稀释比PLK-N19和phosph-Akt1／2／3为1：200：β-tubulin为1：1000）4℃缓慢摇动温育过夜。经TBST洗涤后，HRP偶联的IgG作为二抗（稀释比为1：5000）室温缓慢摇动温育2h，洗膜后，以ECL化学发光法显示结果，胶片扫描后GDS凝胶成像分析系统进行光密度分析，与相应β-tubulin光密度比值作为蛋白的相对表达含量。7．脂质体介导Akt在H9C2（2-1）大鼠心肌细胞中高表达转染方法参照KeyGene TransⅢ转染试剂说明。将生长良好的第4代H9c2（2-1）细胞接种到个25 cm²玻璃培养瓶（1×10⁵个细胞／瓶），当细胞密度达到70％-90％时进行干预。干预因素：①0.05μg／ml胰岛素：50μl胰岛素工作液（1μg／ml）直接加至3ml培养液中；②5μg质粒pCIS2-Akt-WT与10μl KeyGene TransⅢ（1：2）加入500μl转染液中，再加至2.5ml培养液。实验分四组：Ⅰ组对照；Ⅱ组只加②；Ⅲ组只加①；Ⅳ组①②都加。5％CO₂，37℃培养细胞48h。收细胞提取总RNA和蛋白质，检测各组细胞Akt和Fox01的基因表达和Akt的磷酸化水平。8．免疫沉淀方法检测磷酸化p-Histone H3蛋白的表达取上述蛋白上清200μl，加入p-Histone H3单克隆抗体2μl（1：100）；4℃缓慢摇床过夜。加免疫磁珠（protein A or G agarose beads）20μl，4℃缓慢摇床孵育3h。快速点甩30s，500μlPBS洗沉淀5次，冰上操作。20μl 1×样品缓冲液重悬沉淀，短暂离心。样品煮沸5min。其余步骤同Western blot方法。9．免疫荧光方法检测H9c2（2-1）细胞增殖情况和p-Akt1／2／3蛋白在H9c2（2-1）细胞中的定位将生长良好的第5代H9c2（2-1）细胞接种到24孔培养板（1×10⁴个细胞／孔），当细胞密度达到70％-90％时进行干预。处理方法同上（略）。用PBS洗细胞一次，4％多聚甲醛固定30min，余下同上述免疫荧光染色步骤。10．数据处理每组实验重复2-4次，实验数据以均数±标准差（（?）?s）表示，统计处理采用SPSS13.0统计软件进行t检验和x²检验，P＜0.05为显著性差异。实验结果1．发育过程中心肌细胞有丝分裂相关蛋白及mRNA表达（1）大鼠心肌细胞有丝分裂相的形态学观察我们用H3P特异性抗体与FITC标记的二抗相结合，将处于M期的心肌细胞染色体染成绿色，通过染色体的形态可清晰的分辨出有丝分裂相。α-SMA位于胞质，由Cy3染成红色。胞核由Hochest33342染成蓝色，同一视野三种不同颜色的图片叠加以后可以看到处于有丝分裂M期的心肌细胞胞核为蓝绿色叠加，胞质为红色，而其他细胞的胞核仍为蓝色。（2）大鼠心肌细胞的有丝分裂指数检测大鼠心肌细胞的有丝分裂指数随着发育而下降。0天组心肌组织MI为0.905±0.087％，约为2周组（0.372±0.094％）的2.4倍，而4周以后各组几乎观察不到有丝分裂细胞，所有4周以后各组切片中只在成年组发现一个有丝分裂细胞。（3） Akt、plk1和Fox01的表达AktmRNA在生后0天和3天表达水平较高，到7天时明显下降，至成年维持较低水平表达。plk1自出生到7天都有低水平表达，且表达有明显下调趋势，10天后无表达。Fox01的mRNA表达趋势与上述基因相反，0天到10天均表现为中等水平表达，且有逐渐上调的趋势，2周以后表达明显增加，至成年维持较高水平表达。2．心肌肥大时心肌细胞有丝分裂相关蛋白及mRNA表达Fox01基因在大鼠超负荷性心肌肥大时表达下调，而Weel基因表达上调。值得注意的是，AktmRNA的表达没有明显改变，而Akt蛋白的磷酸化水平明显上调。3．Akt／Fox01通路在心肌细胞有丝分裂中作用机制（1） Akt在H9c2（2-1）大鼠心肌细胞内的磷酸化水平检测将H9c2（2-1）大鼠心肌细胞随几分成四组，分别施加胰岛素和pCIS2-Akt-WT两种处理因素，观察这两种因素对心肌细胞内Akt磷酸化水平的影响。转染Akt-WT组和胰岛素组都有明显的磷酸化Akt表达，与对照组相比差异显著；胰岛素组Akt的磷酸化水平明显高于转染Akt-WT组，差异显著。由此可见，转染的外源基因可以促进Akt的磷酸化，而胰岛素对Akt的激活作用更加显著。（2）激活的Akt对H9c2（2-1）大鼠心肌细胞增殖的影响上述四组细胞分别施加处理因素后40小时观察细胞有丝分裂情况。统计处于分裂中期细胞占细胞总数的百分比即为有丝分裂指数（Mitotic Index，MI），与对照组相比，转染组和胰岛素组的MI明显增加，说明激活的Akt能增加心肌细胞的有丝分裂。并且与对照组相比，转染组和胰岛素组的磷酸化组蛋白H3表达明显增加。（3）激活的Akt对Fox01基因表达的影响激活的Akt定位在H9c2（2-1）大鼠心肌细胞的细胞核，可下调H9c2（2-1）大鼠心肌细胞中Fox01基因的表达。讨论我们通过检测生后不同发育阶段大鼠心肌组织H3P的表达，观察心肌细胞增殖现象，发现0天组心肌组织MI为约为2周组的2.4倍，而4周以后各组几乎观察不到有丝分裂细胞，本实验虽不能确定这些有丝分裂细胞能否完成胞质分裂，但可以肯定的是大鼠生后两周内仍有部分心肌细胞进行有丝分裂，随着发育有丝分裂细胞数逐渐减少，至生后4周时几乎检测不到。我们的结果与一些报道相一致。文献指出，哺乳动物心肌细胞生后发育过程只进行有丝分裂，不存在细胞分裂，人类和大鼠的成年心肌细胞中双核细胞的比例分别为60％和85％。据此，我们推测生后进行有丝分裂的心肌细胞中大部分未完成细胞分裂，以双核细胞的形式退出细胞周期。通过检测大鼠生后不同发育阶段心肌组织Akt和Fox01基因表达，我们发现，Akt mRNA在0天和3天组表达水平较高，到7天时明显下调，一直到成年维持较低水平表达，Fox01基因则相反，从0天到10天呈中等水平表达，且有逐渐上调的趋势，2周时明显增加，一直到成年维持较高水平表达。结合我们上面的实验结果，生后两周内大部分心肌细胞退出细胞周期形成双核细胞，由增生性生长向肥大性生长转化，据此，推测在这一过程中Akt的下调和Fox01的上调作为一对矛盾统一体调控心肌细胞增殖停滞。Plks参与调控有丝分裂和细胞分裂的多个阶段。本实验详细探讨plks家族成员中的plk1基因的表达，证实plk1基因的表达下调与心肌细胞有丝分裂减少密切相关。生后有丝分裂的心肌细胞大部分形成双核细胞，plk1的表达下调除了参与心肌细胞有丝分裂活动的退出过程外，还与双核心肌细胞的形成密切相关。在大鼠超负荷性心肌肥大的过程中Akt基因的表达没有明显改变但蛋白磷酸化水平增高，Fox01基因的表达明显下降。Akt-Fox01通路在这个过程中呈相反的表达趋势。前面我们已经讨论过，Fox01基因的表达上调可能是心肌细胞增殖停滞的关键因素，据此推测其在心肌肥大时的表达下调可以解除增殖抑制，促进心肌细胞重新进入细胞周期。Weel作为细胞周期抑制性激酶，在G2／M期转换中起重要作用；本实验检测到Weel基因在压力负荷性心肌肥大时表达上调，我们推测WEE1的增加与许多细胞的G2期停滞有关。为探索哺乳动物心肌细胞增殖机制，人们已经投入了大量的精力。各种生长因子，病毒癌蛋白和细胞周期激动剂的研究显示，这些因素在体外可以诱导DNA的合成，但很少能促进并维持成熟心肌细胞的分裂增殖。在MAPK抑制剂与FGF1联合应用能诱导成熟心肌细胞重新分裂的开创性研究的基础上，我们深入探讨了与MAPK信号密切关联的另一条通路Akt-Fox01对心肌细胞有丝分裂的促进作用。2005年，研究者报道阻断PI3K和Akt通路后，明显降低了心肌细胞的增殖，而抑制MEK信号却没有效果。另有报道，IGF-1受体的抗体能明显抑制心肌细胞增殖，而重新加入IGF-1或IGF-2后能以剂量依赖的形式刺激心肌细胞增殖。本研究通过体外高表达和（或）用胰岛素刺激来激活Akt后，明显促进了H9c2（2-1）心肌细胞的有丝分裂，与上述报道相一致，同时也证实了我们前期实验提出的假设。Akt／PKB信号对心脏的作用取决于其在细胞内的定位。据认为Akt／PKB信号只有在胞核内或在生理条件下短暂激活才对心脏有利。本实验通过胰岛素激活H9c2（2-1）细胞的Akt，明显促进细胞的有丝分裂，而此时磷酸化的Akt定位于胞核。Akt／PKB通过磷酸化Fox01或p27^Kip1等下游底物，使其从胞核移位至胞质而失去活性。p27^Kip1等CDK抑制剂是细胞周期G1／S检查点的负调控因素，而Fox01能够启动p27^Kip1等的转录。因此，Akt／PKB的激活有助于处于G0／G1期的心肌细胞重新进入细胞周期。本实验激活Akt后发现Fox01基因表达下调，提示Akt对Fox01基因除了翻译后修饰的调控方式以外，还可以影响该基因的转录，而Fox01的失活和表达下调是促进心肌细胞有丝分裂的关键因素。结论1．Akt和Fox01在大鼠心肌生后发育过程中的差异表达与心肌细胞周期停滞密切相关。Plk1的表达下调与心肌细胞停止分裂和双核细胞的形成有关。2．压力负荷性心肌肥大时Akt的磷酸化水平上调伴随着Fox01基因的表达下调，可能参与了心肌肥大时心肌细胞的增殖调控。此时Weel基因的表达增加，与进入细胞周期的心肌细胞停滞在G2期有关。3．Akt过表达和胰岛素均可活化H9c2（2-1）细胞的Akt，而且活化的Akt位于H9c2（2-1）细胞的胞核中。核定位的活性Akt通过下调Fox01基因的表达等多种途径促进H9c2（2-1）细胞有丝分裂。