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背景:增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是视网膜脱离及术后的严重并发症,特点是视网膜表面广泛增殖膜的形成,视网膜色素上皮细胞(RPE)是增殖膜中存在的主要细胞类型。RPE细胞迁移于玻璃体腔,通过上皮-间充质转化(EMT)进一步分化成肌成纤维细胞。肌成纤维细胞的连续活化导致纤维组织形成。炎症在PVR起始发挥了重要作用,TNF-α作为一种重要的炎性细胞因子参与到许多纤维化疾病机理中。先前研究表明TNF-α作用于RPE细胞,诱导RPE细胞形态发生变化,并增加了α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。越来越多的研究发现表观遗传机制可促进纤维化的发展,这涉及了许多如转化生长因子-β/Smads等重要的信号通路,还包含多种表观遗传过程,例如DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等,其中我们更关注DNA甲基化和microRNA(miRNA)。DNA甲基化也是近年来治疗多种癌症及免疫疾病的靶标。研究表明DNA甲基化在RPE细胞的EMT中起了重要作用。MeCP2是DNA甲基化的阅读器,在PVR膜及转化的RPE细胞中均有较高的表达。MeCP2参与RPE细胞EMT,并能促进多种组织及细胞纤维化。因此,抗纤维化治疗就要探究PVR起始相关危险因素,了解外部及内在之间关系。Zebularine是一种DNA甲基化转移酶抑制剂,具有较低的细胞毒性。microRNA(miRNA)是短的非编码RNA,通过转录后机制可调控靶m RNA的稳定性或蛋白质翻译。miRNA-132已被证明参与炎症调节,它可通过增强胆碱能抗炎途径负调节炎症反应,还可以抑制活化B细胞的核因子κ轻链增强剂(NF-κB)信号通路。miRNA-132-3p在肾急性损伤和纤维化过渡期高表达抑制炎症反应,表明miRNA-132-3p的表达对疾病纤维化进程也具有影响。miRNA-132是中枢神经系统的重要调节剂,影响神经元形态、记忆及认知,目前发现有多个靶点,其中在下丘脑及海马中发现了靶点MeCP2,它可以通过调节MeCP2的表达来调节基因转录。查阅文献发现在PVR初期TNF-α对MeCP2及miRNA-132表达的影响研究较少。目的:本研究旨在探讨不同浓度及不同处理时间的Zebularine对ARPE-19细胞增殖的影响,不同浓度的TNF-α在早期对ARPE-19细胞MeCP2蛋白表达的影响以及对miRNA-132-3p的影响。方法:将ARPE-19细胞分为对照组及处理组,采用不同浓度(1、10、50、100、200μmol/L)的Zebularine分别处理ARPE-19细胞24h、48h和72h,通过CCK8方法检测450 nm处的吸光值。另外,将ARPE-19细胞分为对照组、单纯PBS处理组、TNF-α处理组,采用不同浓度(10、20、30、40、50 ng/ml)的TNF-α刺激ARPE-19细胞30 min,通过Western Blot检测MeCP2蛋白的表达。将ARPE-19细胞分为对照组、TNF-α处理组,采用不同浓度(10、20、30、40、50 ng/ml)的TNF-α刺激ARPE-19细胞24h,通过Real-time PCR检测miRNA-132-3p的表达水平。利用SPSS23.0统计学分析软件对实验结果进行统计学分析,数据以均数±标准差表示。符合正态分布且符合方差齐性,组间采用LSD两两比较或Dunett Test进行实验组分别与对照组比较;符合正态分布不符合方差齐性,组间采用Tamhane’s T2进行两两比较或多重比较;不符合正态分布,采用非参数检验进行组间差异比较。P<0.05即表示差异具有统计学差异。结果:1.CCK8结果显示,与对照组相比,当处理时间为24h时,Zebularine浓度为200μmol/L可降低ARPE-19细胞生存率,差异具有统计学意义(P<0.05)。当处理时间为48h及72h时,不同浓度(10、50、100、200μmol/L)的Zebularine可随剂量依赖性抑制ARPE-19细胞生存率,差异具有统计学意义(P<0.05)。当Zebularine浓度为200μmol/L、72h时,对ARPE-19细胞的抑制作用最强,细胞存活率显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.Western blot结果显示,TNF-α早期对ARPE-19细胞中的MeCP2表达影响不显著,实验组分别与对照组、PBS组做多重比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.Real-time PCR结果显示,当TNF-α浓度在40 ng/m L,miRNA-132-3p的表达较对照组有明显的下降(P=0.039)。TNF-α浓度在10、20、30、50 ng/m L时(p=0.674、p=0.347、p=0.184、p=0.172)差异均无统计学意义。结论:1.Zebularine能够抑制人RPE细胞增殖,具有剂量和时间依赖性。研究提示甲基化在RPE细胞增殖中具有重要作用。2.TNF-α早期剂量变化对RPE细胞MeCP2蛋白表达影响不明显。3.TNF-α早期可引起炎症反应负调节因子miRNA-132-3p的表达下降,及时有效地抗肿瘤坏死因子治疗对延缓PVR的发展具有重要作用,且miRNA-132是具有研究前景的治疗纤维化疾病的靶标。