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子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。2015年子宫内膜癌在中国的新发病例数约为63400人,死亡率约为21.8%,新发病例数逐年上升,且发病呈年轻化的趋势。2016年美国子宫内膜癌新发病例约为60050人,成为继乳腺癌之后的第二大妇科癌症,严重危害了女性的健康。尽管目前医学诊断和治疗水平已经非常发达,但子宫内膜癌的确切发病机制尚不明确,治疗手段也十分有限。最近,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的发现为探索子宫内膜癌的发病机制提供了分子生物学基础。lncRNA是长度超过200nt不能编码蛋白质的转录本,大量的研究发现其在人类的生命活动及各种疾病的发生发展中发挥了重要的作用。CARLo-5是最近发现的长度为2628个核苷酸的lncRNA,位于原癌基因myc的增强子附近,据报道,CARLo-5在结肠癌、胃癌等多种癌组织中表达上调,在癌症的发生和进展中起着重要作用,对多种癌症的诊断、预后评估和治疗均具有潜在价值。然而,CARLo-5在子宫内膜癌中的表达情况及作用机制尚未见报道。本研究采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法检测正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中CARLo-5基因的表达水平,使用蛋白印迹法(Western-blot)检测细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A的表达情况,深入分析了CARLo-5表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征和总生存期的相关性,并统计分析了CARLo-5基因表达水平与细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A表达水平的相关性。体外敲低子宫内膜癌细胞中CARLo-5的表达后,通过MTS法、Transwell迁移、Matrigel侵袭实验、平板克隆形成实验及流式细胞术检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响。为了探究CARLo-5在子宫内膜癌中的作用机制,本研究通过Western-blot检测了敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞中CDK2、CDKN1A、基质金属蛋白酶MMP2和MMP9表达水平的影响。通过RNAi慢病毒技术构建了稳定敲低CARLo-5的子宫内膜癌细胞株,并进行裸鼠皮下荷子宫内膜癌细胞成瘤实验,检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体内增殖能力的影响。本研究探索了CARLo-5在子宫内膜癌中的作用及机制,利于阐明子宫内膜癌发生发展的分子生物学机制,从而为子宫内膜癌的基因诊断和治疗提供前期实验基础。第一部分CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义目的:研究lncRNA CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达情况,并探讨CARLo-5表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征及总生存期的关系。检测子宫内膜癌组织中细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A的表达水平及其与CARLo-5表达水平的相关性。方法:1采用Real-time PCR法检测108例子宫内膜癌组织和66例正常子宫内膜组织中CARLo-5的表达水平。2采用Western-blot检测子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A的表达情况。3分析CARLo-5的表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征和总生存期的相关性。4分析CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达与细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A表达之间的相关性。结果:1 lncRNA CARLo-5在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达水平Real-time PCR实验结果显示:CARLo-5在子宫内膜癌中的表达水平较正常子宫内膜组织明显升高(P<0.001)。2 CARLo-5的表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征的相关性CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达水平与子宫内膜癌患者的临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05),与患者的年龄、病理类型、病理分级、肌层侵犯深度和脉管浸润无明显相关性(P>0.05)。3 CARLo-5的表达水平与子宫内膜癌患者总生存期的相关性CARLo-5高表达组子宫内膜癌患者的平均生存时间(43.0±14.1月)较CARLo-5低表达组患者(52.5±9.1月)明显缩短(P<0.05)。4子宫内膜癌组织中CDK2和CDKN1A蛋白的表达水平Western-blot结果显示:CDK2蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平(9.32±0.69)较正常子宫内膜组织(1.00±0.54)明显升高,而CDKN1A蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平(0.71±0.14)较正常子宫内膜组织(1.00±0.11)明显降低(P<0.001)。5 CARLo-5的表达水平与CDK2和CDKN1A蛋白表达水平的相关性子宫内膜癌组织中CDK2蛋白的表达水平与CARLo-5的表达呈正相关关系(r=0.30,P=0.043)。CDKN1A蛋白的表达与CARLo-5的表达呈负相关关系(r=-0.28,P=0.046)。结论:1 CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达较正常子宫内膜明显升高,提示CARLo-5可能在子宫内膜癌发生发展中发挥了促进作用。2 CARLo-5高表达与子宫内膜癌患者的临床分期、淋巴结转移和不良预后相关,提示CARLo-5可能成为子宫内膜癌判断预后的分子标志物。3 CDK2蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平较正常子宫内膜明显升高,CDKN1A蛋白表达水平明显降低,且CDKN1A和CDK2蛋白的表达与CARLo-5的表达水平具有明显相关性。这些结果提示,CARLo-5可能部分通过调节CDK2和CDKN1A蛋白的表达而在子宫内膜癌中发挥促癌作用。第二部分CARLo-5对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的:通过调节CARLo-5在子宫内膜癌细胞中的表达情况来探讨其对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及其可能的机制。方法:1采用MTS法检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外增殖活性的影响。2采用Transwell迁移、划痕愈合实验和Matrigel侵袭实验检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。3采用平板克隆形成实验检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞克隆形成能力的影响。4采用流式细胞术检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞增殖周期的影响。5采用Real-time PCR和Western-blot检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞中CDK2和CDKN1A基因及蛋白表达水平的影响。6采用Western-blot检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞中MMP2和MMP9蛋白表达水平的影响。结果:1敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外增殖活性的影响MTS法检测结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的体外增殖活性明显降低(P<0.05)。2敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响Transwell迁移和划痕愈合实验结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的体外迁移能力明显降低(P<0.05);Matrigel侵袭实验结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的体外侵袭能力明显降低(P<0.05)。3敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞克隆形成能力的影响平板克隆形成实验结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的克隆形成能力明显下降(P<0.05)。4敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞增殖周期的影响流式细胞术结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌HEC-1-B和KLE细胞G0/G1期细胞数明显增多,S期细胞数明显减少(P<0.05)。5敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞CDK2和CDKN1A的基因及蛋白表达水平的影响Real-time PCR和Western-blot结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞中CDK2 m RNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),而CDKN1A m RNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.05)。6敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞MMP2和MMP9蛋白表达水平的影响Western-blot结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞中MMP2和MMP9蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:1敲低CARLo-5能抑制子宫内膜癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,提示CARLo-5的表达能够促进子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和转移,CARLo-5有望成为子宫内膜癌治疗的新的生物学靶标。2敲低CARLo-5将子宫内膜癌细胞阻滞在G0/G1期,并抑制CDK2 m RNA和蛋白水平的表达,促进CDKN1A m RNA和蛋白水平的表达,提示CARLo-5可能通过调控CDK2和CDKN1A的表达,抑制细胞G0/G1期阻滞,进而促进子宫内膜癌细胞的增殖。3敲低CARLo-5能够抑制子宫内膜癌细胞中MMP2和MMP9蛋白的表达,提示CARLo-5可能通过上调MMP2和MMP9蛋白的表达来促进子宫内膜癌的转移。第三部分敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究目的:检测稳定敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力的影响,通过裸鼠体内实验来探讨其在子宫内膜癌发生发展中的作用机制。方法:1通过RNAi慢病毒技术构建稳定敲低CARLo-5的子宫内膜癌细胞株。2裸鼠皮下成瘤实验检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体内成瘤能力的影响。3免疫组织化学法实验检测裸鼠移植瘤组织中CDK2和CDKN1A蛋白的表达水平。结果:1敲低CARLo-5在体内对子宫内膜癌细胞的影响sh RNA-1组、sh RNA-2组和对照组裸鼠移植瘤的平均体积分别为(157.66±37.93 mm3)、(102.81±58.33mm3)、(499.74±98.61 mm3),敲低CARLo-5组裸鼠移植瘤的生长速度和重量较未敲低组均明显降低(P<0.05)。2敲低CARLo-5对裸鼠移植瘤组织中CDK2和CDKN1A蛋白的表达水平的影响免疫组织化学结果显示:敲低CARLo-5组裸鼠移植瘤组织中CDK2的蛋白表达水平较未敲低组明显降低(P<0.05),而CDKN1A的蛋白表达水平较未敲低组明显增高(P<0.05)。结论:敲低CARLo-5明显抑制子宫内膜癌细胞的体内增殖活性,其作用机制可能为CARLo-5抑制CDKN1A并促进CDK2蛋白表达,进而促进子宫内膜癌细胞的体内增殖,CARLo-5有望成为子宫内膜癌治疗的新的靶点。