研究目的:先天性纯红系再生障碍性贫血（Diamond Blackfan anemia,DBA）是第一个被报道的核糖体疾病（ribosomopathy）。它是一种罕见的遗传性的骨髓衰竭性疾病,绝大多数病例有核糖体蛋白基因包括小亚基和大亚基的杂合等位基因突变,主要以红系祖细胞BFU-E和CFU-E减少为特征。经典的DBA发病机制是核糖体RNA成熟缺陷,该缺陷会产生核仁应激,导致P53激活并影响其靶标,进一步引起细胞周期停滞和细胞凋亡。糖皮质激素是DBA临床治疗的一线药物,长期使用存在着激素耐药以及激素使用副反应,并且有20%左右的患者激素治疗不响应,只能依靠持续输血或者造血干细胞移植进行治疗,给家庭、社会等造成了沉重的负担。以往基于群体细胞水平的研究,无法解释DBA患者核糖体基因杂合突变在几乎所有类型的细胞都存在,但患者只有特异性红系贫血、其他造血谱系却不受影响的现象。也无法阐明糖皮质激素治疗为何有效的更深层次分子机制。因此,我们通过单细胞转录组测序精细解析DBA的发病机制,寻找新的治疗方法,对DBA患者临床治疗具有重要意义。研究方法:本研究收集5例健康供者和11例DBA患者骨髓样本作为研究材料,健康供者使用流式细胞术分选红系祖细胞BFU-E及少量CFU-E细胞,DBA患者分为初诊（UT）、糖皮质激素治疗有效（GCR）及治疗无效（GCNR）三组,分选BFU-E细胞。使用单细胞转录组测序技术（3’STRT-seq）完成BFU-E及CFU-E细胞建库并进行深度测序。随后进行如下生物信息学分析:1.对测序数据进行严格质控、比对、基因计数,获得基因表达矩阵,随后对健康供者BFU-E细胞进行去除批次效应、降维、聚类分群分析,构建正常BFU-E细胞图谱并推断拟时序发育轨迹;2.将DBA患者BFU-E细胞数据参照健康对照进行映射,得到病人细胞亚群信息;3.寻找DBA患者各亚群与相应健康对照之间的差异基因,并对差异基因进行基因富集分析;4.使用细胞周期计算、基因集打分、GSEA分析、观察重点基因表达水平等方法从生物信息角度验证相关科学假设。最后利用原代细胞（脐带血或DBA患者骨髓来源）及红系祖细胞系（HUDEP2）对生物信息学分析的结果进行实验验证,主要包括:1.克隆形成实验鉴定DBA患者细胞纯度及增殖能力;2.利用红系二相分化体系完成流式染色分析细胞凋亡实验、免疫荧光确定DNA损伤实验、不同浓度糖皮质激素联用I型干扰素梯度培养实验等;3.CFSE实验验证细胞增殖能力等。研究结果:我们基于来自5名健康供者骨髓的红系祖细胞BFU-E绘制了健康供者单细胞转录组图谱,每个细胞可以测到超过3000个蛋白编码基因。通过无监督聚类我们将其分为C0-C4共5个亚群,分别具有核糖体翻译（C0）、转录调控（Cl）、有丝分裂及G2/M细胞周期（C2）、DNA复制及G1/S期转换（C3）、终末红系分化及血红素合成（C4）等特征。随后我们收集了 11个患者骨髓来源的BFU-E红系祖细胞,我们发现,DBA患者BFU-E细胞比例相对于健康对照只有60%,且产生的克隆集落明显较小。通过最近邻（KNN）算法将患者骨髓BFU-E细胞同样分为C0-C4 5个亚群,发现患者BFU-E细胞分化发育阻滞在C3亚群,C4亚群比例大幅降低。进一步分析发现,与健康对照相比,初诊患者（UT）C4亚群凋亡、P53信号通路表达水平显著增加,而糖皮质激素治疗有效患者（GCR）表达则与健康对照类似。我们构建了RPS19缺陷的原代细胞或HUDEP2永生细胞系,均证明在DBA细胞模型中,细胞凋亡水平增加,加入糖皮质激素后降低凋亡。此外我们还发现糖皮质激素可延缓GCR患者红系分化,下调GATA1靶基因表达。对于C3亚群,我们发现UT患者被迫进入细胞周期S期,核糖体单倍剂量不足和DNA复制加快引起矛盾,引起DNA复制压力提升,DNA损伤增加。我们同时也用免疫荧光实验证明RPS19敲减的原代细胞和HUDEP2细胞系DNA损伤显著增加,加入糖皮质激素后DNA损伤水平则大幅降低。和健康对照相比,GCR患者C3亚群Ⅰ型干扰素信号通路表达大幅增加,增殖能力得分较低,相应细胞周期基因表达均降低提示细胞周期延长,DNA复制减慢,由此导致的DNA损伤和凋亡减少,从而使细胞得以存活。对RPS19敲减的脐带血来源原代细胞,联合使用糖皮质激素和IFNα进行浓度梯度培养可促进细胞增殖。使用病人骨髓培养也可发现IFNα单独使用即可促进细胞增殖,联用糖皮质激素可能存在协同效应。CFSE实验证明添加Ⅰ型干扰素培养细胞增殖受到抑制。糖皮质激素治疗使GCR患者Ⅰ型干扰素的靶基因MYC表达下调,从而抑制核糖体生成各过程,降低核糖体基因突变引起的核仁应激。最终GCR患者各亚群核糖体基因表达趋于稳定,这在一定程度上也可以降低游离核糖体数量,减少核仁应激,促进BFU-E更好生存。研究结论:本研究通过3’端单细胞转录组测序（STRT-seq）,构建了正常红系祖细胞和DBA患者BFU-E参考图谱,发现人BFU-E细胞具有异质性。与健康对照相比,DBA患者BFU-E细胞比例降低且增殖能力减弱。由于核糖体基因杂合突变,核糖体单倍剂量不足导致核糖体蛋白合成不足,与BFU-E发育阶段需要DNA大量快速复制产生矛盾,初诊患者红系祖细胞被迫进入细胞周期S期,DNA复制压力增加引起DNA损伤,进而导致P53、凋亡信号通路上调,同时游离核糖体会引起核仁应激,最终导致细胞凋亡。糖皮质激素可降低GCR患者BFU-E细胞凋亡水平,促进细胞生存并延缓红系发育。一方面,通过上调Ⅰ型干扰素信号通路,抑制细胞增殖,延长细胞周期,减弱DNA复制压力;另一方面Ⅰ型干扰素通过靶基因MYC调节核糖体生成各过程,降低核仁应激。综上,我们的研究从单细胞转录组解析了DBA患者发病机制,阐明了糖皮质激素治疗有效分子机理,发现I型干扰素在DBA临床治疗中可能存在巨大潜力,并注册了前瞻性临床试验,拓宽了红细胞研究领域认知,也为其余核糖体病或罕见病的研究提供了参照。