论文部分内容阅读
本文对疏水层析及其相关技术辅助蛋白质重新折叠复性进行了探索。
实验发现，直接采用蛋白质纯化用的商业疏水作用介质不能有效地辅助蛋白质正确折叠，导致较低的活性收率和不可逆吸附；然而在层析流动相中加入甘油则能够克服上述问题，促进了蛋白质的正确折叠。由此，本文建立了甘油介导下疏水层析辅助蛋白质折叠复性技术。应用此技术复性溶菌酶，蛋白终浓度为1.2mg/m1，蛋白回收率达到85％，总活性回收率为86.3％，产物达到天然比活性；应用此技术复性重组α-2b干扰素，蛋白终浓度达到1.1mg/ml，蛋白回收率达到84％，比活为3.0×108IU/mg；而采用传统的稀释法，复性溶菌酶的蛋白回收率仅为32.6％，复性重组α-2b干扰素的蛋白回收率为59％，比活只有0.4×108IU/mg。
为克服现有商业疏水作用介质的不足，本文采用固定化技术，制备了聚乙二醇(PEG)介质、聚合环糊精(β-CD)介质和TritonX-100介质，分别对重组金黄色葡萄球菌肽链翻译延长因子(EF-G)和重组绿色荧光蛋白(GFP)包涵体蛋白质进行了折叠复性。采用固定化聚乙二醇(PEG)介质辅助EF-G复性，解决了稀释复性产生沉淀和错误折叠的难题，得到了浓度为580μg/ml的产物，蛋白回收率为88％，正确折叠率达到80％。而稀释复性的蛋白回收率为49％，正确折叠率含量只有46％。
采用聚合环糊精(β-CD)介质，与表面活性剂TritonX-100相结合复性EF-G。将TritonX-100与EF-G结合形成复合物，通过聚合环糊精(β-CD)介质柱吸附TritonX-100，释放出EF-G进行折叠，在复性产物蛋白浓度530μg/ml下，蛋白回收率为98.7％，正确折叠含量达到100％。采用空白介质、固定化β-CD单体介质和直接穿过方法均不能有效折叠EF-G。
将TritonX-100作为固定相，采用β-CD为流动相是本文发展的又一复性系统。将GFP包涵体变性蛋白质吸附到固定化TritonX-100柱上后用β-CD洗脱，复性产物蛋白浓度为380μg/ml，蛋白回收率为64％，正确折叠产物含量提高到46％。采用稀释复性得到的正确折叠产物含量仅为4.7％。