研究背景及研究目的:研究背景:肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是病变仅限于肺部的,病因不明确的纤维化疾病。PF的发病机制至今仍不明确。目前对PF患者的治疗多采用吡非尼酮、尼达尼布、氧疗、有创/无创机械通气,肺移植。因为上述方法费用成本高,疗效不显著,移植供体不足或免疫排斥反应、患者医从性差限制了其广泛应用,因此积极探索肺纤维化的发病机制及研发新的干预药物就显得十分重要。氨磷汀(Amifostine,AMI)作为一种各种恶性肿瘤病人放疗所使用的细胞膜保护剂,可以减轻肺组织损伤及肺纤维化,但AMI在对博来霉素所致肺纤维化的研究甚少。目的:通过博来霉素诱导小鼠肺组织纤维化的动物模型,观察氨磷汀对小鼠肺纤维化组织的保护作用,同时探讨氨磷汀治疗肺纤维的作用机制及干预靶点。材料与方法:1、实验动物分组及动物模型的建立:120只雄性,健康SD小鼠,动物分组:空白组,溶媒组,模型组,药物组,干预组,采取随机法进行分组,各组小鼠均为24只。模型组小鼠气管内缓慢注入200ul盐酸博莱霉素溶液(5mg/kg),干预组小鼠气管内注入200ul博莱霉素溶液(5mg/kg),药物组小鼠气管内注入200ul氨磷汀注射液(40mg/kg),溶媒组小鼠气管内注入200ul无菌生理盐水,空白组不做任何处理。造模后每日干预组小鼠腹腔注射200ul氨磷汀注射液;药物组小鼠每日腹腔注射200ul氨磷汀注射液,溶媒组及模型组小鼠每日各腹腔注射200ul等量的无菌生理盐水。2、观察及记录小鼠在实验过程中的的饮食、活动、呼吸、体重等变化情况。分批次取8只小鼠肺组织,观察各组小鼠在实验第7、14、28天外观、体积、弹性,比较各组小鼠肺脏重量及肺系数变化情况。3、纤维化程度差别比较:比较各组小鼠在造模后第7、14、28天纤维化程度(HE染色、masson染色,Ashcroft评分)。4、氨磷汀干预机制研究:免疫组化比较各组小鼠在造模后第7、14、28天肺组织中TGF-β1、Smad-2、E-Cad、α-SMA表达。Western blot比较各组小鼠第28天TGF-β1、Smad-2、E-Cad、α-SMA蛋白表达情况。5、药物安全性研究:观察氨磷汀对小鼠饮食、摄水、活动、正常肺组织、肝功能、肾功能影响情况。结果:1、小鼠的一般情况:空白组、溶媒组、药物组:三组小鼠在整个实验期间饮食、摄水、活动均无异常表现,呼吸频率正常,体重增加,无毛发脱落。肺系数无明显增加或降低。模型组:小鼠在整个实验期间饮食、摄水逐渐变差、活动减少,纳差、食欲减退等表现逐渐加重,毛发脱落,呼吸增快,体重较入组时明显减少,肺系数逐渐增加。干预组:小鼠的呼吸、反应、体重、进食、饮水,肺系数等情况劣于空白组,优于模型组。肺组织肉眼观察情况:空白组、溶媒组、药物组:三组小鼠解剖肺组织体积正常无缩小,肉眼观察组织呈粉红色,触之饱满、表面无出血点、弹性均佳。模型组:肺组织体积变小,触摸组织表面不光滑,弹性变差,质地硬。干预组:小鼠肺组织体积稍缩小,表面局部呈暗红色,可见少许散在出血点。触摸组织表面部分不光滑,弹性稍差,质地稍硬。总体肉眼观肺组织情况优于模型组,劣于其余三组。2、各组肺组织纤维化比较:(1)HE染色:空白组、溶媒组、药物组:小鼠肺组织在各时间点(7天,14天,28天)肺泡腔均清晰可见,结构均完整,肺泡间隔均未见增宽,均未见炎性细胞浸润,均未见纤维蛋白沉积。模型组:第7天,肺组织以炎症改变为主,炎症细胞渗出;随时间进展,肺泡组织炎症加剧,纤维化程度也越重,肺泡腔炎性细胞(以中性粒细胞为主)越多,胶原纤维也越多,肺组织破坏程度越明显,部分肺组织实变,于第28天程度最重。干预组:第7天,肺组织见炎性细胞(以中性粒细胞为主)渗出;随时间进展,炎性细胞数量、纤维化范围也越来越明显,但总体肺组织情况优于模型组,劣于其余三组。(2)masson染色:空白组、溶媒组、药物组:实验第7天、第14天、第28天masson染色实验结果表明,三组小鼠肺组织在各时间点(7天,14天,28天)肺组织未见破坏,均无炎症细胞浸润及纤维化表现,肺泡腔内未见蓝色胶原纤维。模型组:实验第7天,小鼠肺泡肺组织内见少许炎症细胞及蓝色胶原纤维。随时间进展,肺泡破坏越多,肺组织炎症反应越重,纤维化程度越重,肺组织破坏越明显,于第28天程度最重,与上述三组在节点两两相比,比较有差异(P均<0.05)。干预组:第7天,小鼠肺泡腔内见少量炎症细胞浸润及蓝色胶原纤维。随时间进展,肺组织破坏、炎性细胞、胶原纤维也均呈上升趋势,肺组织炎症及纤维化程度在各时间点优于模型组,劣于其余三组,比较有差异(P<0.05)。(3)Ashroft评分:三组小鼠(空白组、溶媒组、药物组)在实验第7天、第14天、第28天Ashroft评分两两相比,比较无差异(P>0.05)。模型组与空白组、溶媒组、药物组在各时间点两两相比,Ashroft评分逐渐增加,比较有差异(P<0.05)。干预组Ashroft评分在各节点低于模型组,均高于其余三组,比较有差异(P<0.05)。3、干预机制:(1)通路蛋白表达情况:实验第7天、第14天、第28天实验免疫结果表明,空白组、溶媒组、药物组TGF-β1、Smad-2低表达,模型组与空白组、溶媒组、药物组在各时间点两两相比,模型组中TGF-β1、Smad-2逐渐增加,比较有差异(P<0.05);干预组中TGF-β1、Smad-2表达各时间点低于模型组,高于上述三组,比较有差异(P<0.05);实验第28天Western blot结果表明,空白组、溶媒组、药物组TGF-β1、Smad-2蛋白低表达,模型组与空白组、溶媒组、药物组两两相比,模型组中TGF-β1、Smad-2蛋白逐渐增加,比较有差异(P<0.05);干预组中TGF-β1、Smad-2蛋白表达低于模型组,高于其余三组,比较有差异(P<0.05)。(2)上皮间质转化相关蛋白:实验第7天、第14天、第28天实验免疫组化结果表明,空白组、溶媒组、药物组E-Cad高表达,α-SMA低表达,模型组与空白组、溶媒组、药物组在各时间点两两相比模型组中E-Cad表达逐渐减少,α-SMA表达逐渐增加,比较有差异(P<0.05);干预组中E-Cad在各时间点高于模型组,低于上述三组(P<0.05);α-SMA在各时间点表达低于模型组,高于其余三组(P<0.05);实验Western blot结果表明,空白组、溶媒组、药物组E-Cad蛋白高表达,α-SMA蛋白低表达,模型组与空白组、溶媒组、药物组两两相比模型组中E-Cad蛋白表达逐渐减少,α-SMA蛋白量表达逐渐增多,比较有差异(P<0.05);干预组中E-Cad蛋白高于模型组,低于上述三组,比较有差异(P<0.05);α-SMA蛋白低于模型组,高于上述三组,比较有差异(P<0.05)。4、药物安全性结果:氨磷汀对小鼠饮食、摄水、活动无影响,对正常肺组织无损伤,对肝肾功能无影响。表明氨磷汀(40mg/kg)是治疗肺纤维化的安全剂量。结论:1、小鼠肺组织纤维化模型可通过经气管滴注博来霉素实现。2、氨磷汀通过减轻炎症反应、抑制胶原沉积,延缓肺纤维化。3、氨磷汀下调TGF-β1/Smad-2,抑制EMT,延缓肺纤维化。4、氨磷汀延缓肺纤维化,药物安全性高,值得临床推广应用。