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禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)和禽肉瘤病病毒(ASV)群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。存在于鸡上的ALV主要为A、B、C、D、E和J等亚群,其中A、B、J亚群为临床常见的外源性病毒,可造成各种肿瘤性死亡或生产性能的下降。ALV既可垂直传播,又能水平传播,种群净化是防止病毒持续存在的有效方法。p27是ALV基因组中gag基因编码的群特异性抗原,是病毒核心衣壳蛋白的主要成分。本研究制备了针对p27抗原的单克隆抗体,并建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,为禽白血病的净化工作提供一种简便方法。本研究首先设计了一对针对p27基因的特异性引物,采用PCR方法扩增出本室分离保存的JS-9-09-Ch株ALV的p27基因并进行测序,上传序列至GenBank获得登录号为：JF911742。与ALV-J HPRS-103毒株(登录号：Z46390)p27基因序列比对,同源性为94.8%。对PCR产物进行纯化,然后克隆到pET-32a(+)和pGEX-6P-1载体,分别转化到BL21(DE3)和BL21菌株进行培养。挑选转化成功的阳性质粒菌株,用IPTG进行诱导表达,收获菌液进行超声波裂解,将沉淀和上清分开处理后作SDS-PAGE鉴定,在两种菌液上清中分别出现目的条带的表达,His-p27蛋白为43kDa, GST-p27蛋白为53kDa。用High-Affinity Ni-IDA Resin和High-Affinity GST Resin对目的蛋白His-p27和GST-p27分别进行纯化。将纯化后的GST-p27蛋白用弗氏完全佐剂乳化后免疫8周龄BALB/c小鼠,间隔两周加强免疫一次(第二、三次免疫用弗氏不完全佐剂)。第三次免疫后两星期用等量抗原(不加佐剂)加强免疫一次,三天后取小鼠脾细胞与骨髓细胞瘤细胞SP2／0融合。用纯化的His-p27蛋白包被ELISA反应板,对融合成功的杂交瘤细胞进行筛选。选取阳性孔进行亚克隆,共获得稳定分泌抗p27抗原的单抗杂交瘤细胞系5株,分别命名为3G6、4A11、4C7、4C9、7F4。以每只BALB/c小鼠腹腔注射50万个杂交瘤细胞的数量制备腹水。3G6、4A11效价为1:102400,4C7、4C9、7F4效价为1：204800。单抗3G6、4A11、4C7、4C9亚类为IgG1,7F4为IgG2b。5株单抗均具有良好的群特异性,仅与ALV-A、ALV-B、ALV-J反应,与感染鸡的NDV、IBV、REV无交叉反应。Western-blot和IFA试验结果表明,所获单抗针对ALV核衣壳蛋白p27抗原。采用竞争ELISA方法筛选出针对p27不同抗原表位的单抗7F4和4C7,分别采用Protein G和Protein A亲和层析方法进行纯化。应用方阵试验确定包被单抗7F4的最佳工作浓度为1μg/mL(1：1000稀释),辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗4C7(4C7-HRP)的最佳工作浓度为0.5μg/mL(1：200稀释)。建立的ELISA方法与ALV-A、ALV-B、ALV-J反应,与NDV、IBV、REV无交叉反应。检测His-p27蛋白敏感度可达到16ng/mL。与IDEXX禽白血病病毒抗原检测试剂盒比较对临床采集的182份鸡泄殖腔棉拭子样品的检出率,符合率为95.6%。