西番莲种籽中类黄酮的提取、分离纯化、结构鉴定及抗氧化活性研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:libra_15
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本论文以紫果西番莲种籽为原料,以类黄酮为研究对象,利用响应面法优化了西番莲种籽中类黄酮的提取工艺。采用大孔树脂柱层析法对提取的类黄酮粗提产物进行纯化。以DPPH、、自由基清除率和总还原力等指标评价纯化产物的体外抗氧化活性,并通过皮下注射D-半乳糖构建氧化损伤小鼠模型,评价纯化产物的体内抗氧化活性。利用显色反应、紫外光谱、红外光谱、液相质谱联用等方法对种籽中类黄酮成分构成进行了推测。具体研究结果如下:(1)以紫果西番莲种籽为原料,利用有机溶剂回流提取法和超声波、微波双辅助法两种方法研究了类黄酮的提取工艺。通过单因素和正交优化试验,得出有机溶剂回流提取法的优化工艺条件为:乙醇体积分数70%,料液比1:60 g/m L,提取温度90℃,提取时间2.5h,种籽中类黄酮提取量为151.34mg/g。通过单因素和响应面优化试验,采用二次多元线性回归方程进行拟合,得出超声波、微波双辅助法的最佳工艺条件为:超声温度80℃、乙醇体积分数73.78%,料液比1:56.02 g/m L,超声功率300w,超声时间50min,微波功率160w,微波时间90s,种籽中类黄酮提取量为117.53mg/g。可见虽然类黄酮提取含量降低了22.34%,但超声波、微波双辅助法与有机溶剂回流提取法相比,提取时间缩短了2/3。(2)以超声波、微波双辅助法提取的西番莲种籽中类黄酮粗提液为原料,比较了6种不同类型的大孔树脂对种籽中类黄酮的吸附解析性能,从中筛选出AB-8树脂为快速平衡型树脂。考察了样品浓度、最大上样量、水洗剂用量、洗脱剂用量等柱层析条件,最终确定样品浓度为1.0mg/m L,最大上样量为270m L,水洗剂用量为150m L,洗脱剂用量为90m L,作为AB-8树脂纯化工艺单因素试验的基础条件。通过单因素和正交优化试验,得出优选纯化工艺为:上样流速9r/min,上样p H3,洗脱流速12r/min,乙醇体积分数70%,类黄酮回收率为89.67%。对比纯化前后的样品纯度可知,AB-8大孔树脂纯化后西番莲种籽中类黄酮的纯度由原来的58.58%提高至72.84%。(3)比对西番莲种籽中类黄酮纯化产物和粗提产物的DPPH、ABTS+·、·OH自由基清除率和总还原力,及其体外抗氧化活性。结果表明:DPPH、ABTS+·、·OH自由基清除率和总还原力随着样品浓度的增加,呈现逐渐上升的趋势。纯化产物的DPPH、ABTS+·、·OH自由基清除率IC50值均小于粗提产物,表明提高黄酮纯度,样品体外抗氧化能力也随之提高。构建D-半乳糖氧化损伤动物实验模型,以西番莲种籽中类黄酮纯化产物灌胃给药,测定体质量、超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和蛋白质羰基等多种生化指标,评价种籽中类黄酮作为外源性抗氧化剂的体内抗氧化活性。结果表明:与空白组相比,模型组小鼠体质量,肝、肾组织的T-SOD、CAT、GSH-PX活力,GSH含量和血清的T-SOD活力均显著降低(P<0.05),肝、肾组织的MDA、蛋白质羰基含量和血清的MDA含量均显著升高(P<0.05),表明氧化损伤模型建造成功。与模型组相比,各剂量组随着黄酮灌胃剂量的增大,T-SOD、CAT、GSH-PX活力,GSH含量和小鼠体质量逐渐增大,MDA、蛋白质羰基含量逐渐降低,灌胃剂量与抗氧化作用存在显著量效关系。与VC阳性对照组相比,在提高GSH含量和CAT、GSH-PX活力,降低MDA、蛋白质羰基含量方面,中、高剂量组类黄酮的作用效果较好,且高剂量效果强于VC。(4)采用显色反应、紫外光谱、红外光谱、液相-质谱联用等方法分析和推测种籽中类黄酮的构成成分。结果表明:显色反应推测纯化产物为A环C5位存在羟基的黄酮类;紫外光谱显示出黄酮类的特征吸收峰,加入诊断剂进行紫外光谱鉴别并结合显色反应推测得,纯化产物中黄酮类物质A环有C5位取代的邻二酚羟基,B环有C4’位取代的邻二酚羟基;红外光谱中各官能团吸收峰信息表明:纯化产物具有完整的黄酮基本骨架,确定该纯化产物属于黄酮类;对纯化产物进行液质分析,运用分子特征提取技术(MFE)获取检测到的化合物信息,得到分子量、分子式、一级质谱信息及二级质谱信息,结合文献报道,推测裂解途径,推断出四种黄酮苷元,分别为:2-(3,4-二羟基苯基)-5,7-二羟基-6-异戊基-4H-苯并吡喃-4-酮,2-(4-羟基苯基)-3,6-二甲氧基-8,8-二甲基-4H,8H-吡喃并[2,3-f]苯并吡喃-4酮,5-羟基-2-(4-羟基-3-甲氧苯基)-3-甲氧基-7-((3-甲基-2-丁烯-1-基)氧代)-4H-苯并吡喃-4-酮,7-((4-甲氧苄基)氧代)-3-(2-甲氧苯基)-2-羧酸乙酯-4H-苯并吡喃-4-酮。
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