第一部分绿色荧光蛋白(GFP)转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体外培养与诱导分化的实验研究目的探讨绿色荧光蛋白转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞(GFP-NSC)体外增殖、分化的生物学活性，并探索一种体外诱导神经干细胞向神经元分化的培养方法。方法1、对GFP转基因大鼠的胚胎脊髓神经干细胞进行体外分离、培养和诱导分化，并应用特异性抗体分别对神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞进行免疫荧染色鉴定。2、神经干细胞体外连续传代3次以上，在原有神经干细胞培养液中加入Laminin和Heparin两种成份，继续体外悬浮培养5天。之后更换为神经干细胞分化液，诱导神经干细胞体外贴壁分化。分化2周后，应用神经元特异性抗体对神经元进行免疫荧光染色，计数神经干细胞分化为神经元的比例。并应用RT-PCR对分化细胞中突触素的表达量进行半定量检测。以神经干细胞经常规体外培养和诱导分化获得的神经终末细胞作为对照组。结果1．通过体外分离培养的方法获得了稳定传代的GFP-NSC，经体外诱导分化可以形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。2．本实验改进的胚胎脊髓神经干细胞体外诱导培养方法，使神经干细胞体外分化为神经元的比例明显增加，由原来的不足7％增加到20％以上。结论1．GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞具有正常神经干细胞的特点，具有良好的生物学活性。2．本实验采用的诱导神经干细胞向神经元分化的方法，可以明显提高神经干细胞分化为神经元的比例，为进一步研究神经干细胞体内分化及体内移植防治骨骼肌失神经萎缩奠定了基础。第二部分移植神经干细胞在周围神经内存活与分化的实验研究目的应用不同方法处理GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞，对其移植于周围神经内的存活与分化情况进行研究。方法1．构建携带神经营养因子NT3的慢病毒载体，并转染神经干细胞。2．建立F344大鼠胫神经切断的动物模型，将神经干细胞(实验组1)、经过体外向运动神经元诱导的神经干细胞(实验组2)及同时转染NT3的神经干细胞(实验组3)分别制成单细胞悬液移植于胫神经远侧段。细胞移植后4周、12周取材。分别应用神经元、运动神经元、神经胶质细胞、轴突以及突触素等的特异性抗体对胫神经冰冻切片进行免疫荧光染色，应用乙酰胆碱受体和突触素的特异性抗体对肌肉组织冰冻切片进行免疫荧光染色。对神经干细胞体内是否能够分化为神经元和运动神经元，分化形成的运动神经是否能够发出轴突，以及分化形成的神经元是否能够与失神经肌肉建立突触连接等问题进行研究，并比较各实验组神经干细胞体内分化情况的变化。结果GFP-NSC移植于周围神经后，可以长期存活，可以分化形成星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、运动神经元，而且分化形成的神经元可以发出轴突向远端生长。细胞移植后12周，实验组失神经肌肉表面突触素大量聚集，突触后膜形态较好，已接近正常肌肉突触后膜的形态。经体外诱导的神经干细胞体内移植后向神经元分化的比例明显提高而且时间提前；经体外诱导并转染NT3的神经干细胞分化为神经元的比例进一步提高。根据各组中神经元分化比例、运动神经元出现时间及突触素表达强度等结果进行比较，实验组3优于实验组2，实验组2优于实验组1。结论1．GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体内移植后可以分化为运动神经元，并可以发出轴突到达失神经肌肉；2．神经干细胞经过体外向运动神经元诱导或同时转染NT3以后，其体内分化为神经元的比例明显提高，而且神经元出现的时间也明显提前。该结果为进一步研究神经干细胞体内移植防治骨骼肌失神经萎缩奠定了基础。第三部分神经干细胞移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究目的探讨神经干细胞移植于周围神经后，对于延缓失神经肌肉萎缩的效果。方法建立F344大鼠胫神经切断的动物模型，将神经干细胞(实验组1)、经过体外向运动神经元诱导的神经干细胞(实验组2)以及体外诱导同时转染神经营养因子NT3的神经干细胞(实验组3)分别制成单细胞悬液移植于胫神经远侧段。细胞移植后4周、12周取材。测量小腿三头肌肌湿重，并分别应用HE染色、Mallory三色染色的方法对失神经肌肉组织进行染色，同时应用突触后膜乙酰胆碱受体(AchR)特异性抗体对肌肉冰冻切片进行免疫荧光染色。应用图像分析软件对各组动物腓肠肌纤维截面积和突触后膜面积进行测定，并进行统计学分析。结果各组动物失神经肌肉之肌湿重、肌纤维截面积和突触后膜面积均出现不同程度的下降，但三个实验组结果均优于对照组，各实验组间比较，实验组3优于实验组2，实验组2优于实验组1，结果经统计学分析，存在显著性差异。结论1．GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体内移植后发挥了延缓失神经肌肉萎缩的作用，同时对维持突触后膜的形态发挥了重要的作用。2．神经干细胞经过体外向运动神经元诱导或同时转染神经营养因子NT3后，其延缓肌肉萎缩的效果明显增强。