Afper1调控黄曲霉生长及产毒机理研究

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黄曲霉(Aspergillus flavus)侵染农作物并产生致癌性的次级代谢产物黄曲霉毒素B1(AFB1),严重危害人类健康,并对农业生产造成巨大经济损失,深入研究黄曲霉生长及毒素合成调控机理具有重要的现实意义。研究表明,GPI锚定蛋白的合成能够影响黄曲霉生长及毒素合成,然而Afper1作为参与GPI锚定蛋白脂质重塑的关键磷脂酶,其调控黄曲霉生长发育及毒素合成的机理仍不清楚。本研究以野生型(WT)黄曲霉、Afper1缺失株及其回补菌株为研究对象,以AFB1生物合成调控网络为中心,通过基因敲除、定量蛋白组学等生物学研究方法,对Afper1调控胞内总蛋白图谱进行分析,确定与调控AFB1合成相关联的差异蛋白;考察差异蛋白亚细胞定位及其缺失、回补菌株的生长特性,对AFB1合成的影响及相关基因转录水平的变化,解析其对AFB1合成的调控作用。主要研究结果如下:(1)生物信息学分析表明黄曲霉的Afper1蛋白(AFLA_127360)与构巢曲霉的同源性最高,该蛋白在C末端有一个保守的磷脂酶结构域,与灰绿曲霉、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌等真菌有高度相似性;亚细胞定位结果显示,黄曲霉Afper1蛋白主要在细胞核发挥生物学功能。(2)生理生化指标分析表明Afper1蛋白对黄曲霉生长、产孢、产毒等均有明显的抑制作用,完全抑制菌核形成,同时缺失Afper1蛋白后的黄曲霉对肉桂醛、麝香草酚、香芹酚等植物精油敏感性提高8倍以上,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定产孢、产毒、产菌核等基因的转录水平,测定结果与测得生理生化指标结果一致。(3)定量蛋白组学分析结果发现,负责调控胞外酶合成的差异蛋白显著减少,抑制了黄曲霉的生长发育;内质网稳态相关蛋白显著上调,同时发现负责清除活性氧(ROS)的酶,包括catA、catB、cpeB和sodM均出现显著下调,进而导致胞内ROS的增加,测定ROS含量及相应酶活(CAT、SOD、POD)验证了组学数据。实验结果表明缺失Afper1蛋白后黄曲霉胞内ROS过多积累,氧化还原系统发生紊乱,抑制了AFB1的生物合成。
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