膀胱移行细胞癌（Bladder Transitional Cell carcinoma,BTCC）是泌尿系最常见的恶性肿瘤,具有异质性与高复发性,初诊时70%-80%患者为浅表性,术后复发率为50%-70%,且在复发中又有10%-30%由表浅性进展为侵润性肿瘤,更有20%-30%患者初诊时即具有侵袭性或远处转移,即使通过手术切除肿瘤,其中仍约有半数病例在术后2-3年内死亡。由此可见,肿瘤复发、侵润性生长和转移已成为影响膀胱癌治疗效果与预后的主要原因。但目前对于BTCC侵袭、转移、复发的机制尚不完全清楚。巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage Migration InhibitoryFactor,MIF）于1966年Bloom和Bennett等首次发现并命名。尽管MIF发现较早,但对该结构与功能的研究直到1989年cDNA被克隆后,才逐渐深入。到目前为止,认为MIF是一种独特的促肿瘤发生的细胞因子,MIF可能直接影响正常细胞的分裂和癌基因诱导的恶性转化,还通过调节免疫反应、抑制抑癌基因P53的功能和促进肿瘤血管生成,从多个层次促进肿瘤的发生和发展。MIF在肿瘤中的研究已成为近年来研究的热点之一,但是其在BTCC中的研究国内外尚未见文献报道,亦无MIF反义RNA转染膀胱癌细胞的实验研究报道。鉴于以上原因,本实验主要研究MIF与BTCC发生发展的关系、可能作用机制及临床潜在价值。第一章膀胱移行细胞癌中MIF基因的表达及其与MMP9表达的相关性研究[目的]探讨膀胱移行细胞癌（BTCC）中巨噬细胞移动抑制因子（MIF）表达的临床意义及其与基质金属蛋白酶9（MMP9）的关系。[方法]采用免疫组化和RT-PCR技术从蛋白和基因水平检测43例BTCC及10例正常膀胱粘膜组织中MIF的表达,观察:（1）MIF表达与肿瘤临床分期、病理分级的关系;（2）MIF与患者术后复发及预后的关系。（3）MIF与MMP9的关系。[结果]免疫组化结果:（1）膀胱癌组织中MIF蛋白高表达;而正常膀胱上皮组织无表达。（2）MIF蛋白的表达水平随临床分期的增高而显著增强（P＜0.01）,而与BTCC病理分级无关（P＞0.05）。（3）MIF的高表达是患者预后不良的危险因素。（4）膀胱癌组织中基质金属蛋白酶-9（Matrix Metal loproteinase-9,MMP9）蛋白高表达;而正常膀胱上皮组织无表达。RT-PCR结果:（1）所有膀胱癌组织中MIFmRNA均有表达,而正常膀胱癌组织中无1例表达。（2）MIFmRNA的表达水平随临床分期的增高而显著增强（P＜0.05）,而与BTCC病理分级无关（P＞0.05）。（3）膀胱癌组织中MMP9mRNA的表达异常增高;而正常膀胱上皮组织无表达。（3）BTCC中MIFmRNA的表达与MMP9mRNA的表达具有相关性（pearson系数=0.470,P=0.018）,MIF可能从转录水平促进MMP9的表达。[结论]MIF基因mRNA水平和蛋白水平均表明:MIF在膀胱移行细胞癌中表达异常增强,其表达在BTCC侵袭进展过程中起重要作用;MIF可能是评估患者预后一个有用指标。MMP9在膀胱移行细胞癌中表达增强。膀胱移行细胞癌中MIF与MMP9的表达具有相关性,高表达的MIF可能从转录水平促进MMP9的表达。第二章MIF反义RNA真核表达载体的鉴定及其抑制BIU-87细胞MIF表达[目的]为研究MIF反义RNA对膀胱癌细胞体外生物学的影响,建立并鉴定能稳定表达MIF反义RNA的膀胱癌细胞株,探讨其对MIF表达的影响。[方法]将pSecTag-MIF、pcDNA₃-antiMIF和空载体pSecTag、pcDNA₃质粒及荧光质粒PN3-EGFP分别转化细菌、扩增提取纯化后,应用脂质体介导的方法,pcDNA₃-antiMIF、空载体pcDNA₃分别转染体外培养的膀胱癌细胞株BIU-87,G418筛选抗性克隆并扩大培养传代,利用RT-PCR,Wester-Bloting和细胞免疫组化法分别分析其对目的基因MIF在mRNA和蛋白水平的表达的影响。[结果]pcDNA₃-antiMIF转染细胞克隆较小,生长较慢。pcDNA₃-antiMIF转染细胞株和空载体转染细胞株均获得G418抗性:RT-PCR,western blot和细胞免疫组化法显示MIF反义RNA转染细胞株目的基因MIF在mHNA和蛋白水平上表达均较空载体转染细胞株和未转染细胞株减弱。[结论]成功构建分别能稳定表达pcDNA₃-antiMIF和空载体pcDNA₃的膀胱癌细胞株,且pcDNA₃-antiMIF质粒转染对细胞MIF的表达具有抑制作用,为下一步MIF的功能研究提供了实验基础。第三章MIF基因反义RNA干扰载体导入对膀胱癌细胞株BIU-87体外增殖和凋亡行为的影响[目的]研究MIF反义RNA转染对膀胱癌细胞株体外增殖和凋亡行为的影响及其可能机理。[方法]以我们成功构建的分别能稳定表达pcDNA₃-antiMIF和空载体pcDNA₃的膀胱癌细胞系和未转染的BIU-87细胞为研究对象,细胞计数细胞生长曲线绘制法比较三种细胞的生长曲线变化,MTT法检测三组细胞的存活率的变化,流式细胞仪检测三组细胞周期和凋亡的改变。[结果]与其他二组相比,pcDNA₃-antiMIF转染细胞系细胞生长速度明显减慢,细胞存活率明显下降,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞减少,同时凋亡增加,差异具有显著性（P＜0.05）,而其他二组之间无明显差别。[结论]pcDNA₃-antiMIF稳定转染可抑制膀胱癌细胞的体外生长,这种抑制作用可能与MIF表达下调,引起细胞周期G0/G1期阻滞和细胞凋亡有关。第四章MIF基因反义RNA干扰载体导入对膀胱癌细胞株BIU-87体外迁移侵袭能力的影响[目的]研究MIF反义RNA转染对膀胱癌细胞株体外迁移侵袭能力的影响及其可能机理。[方法]以稳定表达pcDNA₃-antiMIF和空载体pcDNA₃的膀胱癌细胞系和未转染的BIU-87细胞为研究对象,利用细胞粘附实验、划痕实验及Millicell PCF小室检测癌细胞体外侵袭力的变化。[结果]pcDNA₃-antiMIF转染组细胞侵袭力明显低于空载体pcDNA₃和未转染的BIU-87细胞（P＜0.05）,且MMP9mRNA的表达也明显下降。[结论]pcDNA₃-antiMIF稳定转染可抑制膀胱癌细胞的体外迁移侵袭能力,这种抑制作用可能与MIF表达下调引起MMP9表达下降有关。