肥胖是由于能量代谢失衡导致的一种病理状态,其对人体的危害巨大。肥胖的核心是机体将多余能量以脂肪形式储存于白色脂肪细胞而导致体内白色脂肪组织异常积聚和分布。因此如何健康、有效的减少白色脂肪组织含量是肥胖治疗的关键问题。人体内还存在一类以往被忽视的脂肪组织——棕色脂肪组织,由于其可以“燃烧”脂肪为热能的强大能力及健康方式而成为肥胖治疗的理想靶标。白色脂肪在特定条件下也具备类棕色脂肪的特征,这种现象被称为白色脂肪棕色化或米色化。长链非编码RNA(Longnon-coding RNA,lncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的非编码RNA分子,组成了人类基因组非编码转录本的大部分,在生命活动中发挥着重要的作用。其作用形式多样,与X-染色体灭活、基因组印记、染色质修饰、转录激活与抑制、RNA剪切等密切相关。LncRNAs是否在白色脂肪细胞棕色化中发挥调节效应,目前未见相关报道。为筛选可能参与白色脂肪棕色化效应的lncRNAs,我们利用基因芯片技术,通过比较白色脂肪与棕色脂肪组织中lncRNAs组成差异,发现了一条高表达于棕色脂肪组织,而低表达于白色脂肪组织的长链非编码RNAGM13133。通过生物信息学分析对其基本特征与潜在功能预测发现,GM13133全长736bp,定位小鼠染色体4qE2,位于PRDM16基因的第一个内含子内,转录方向与PRDM16相反。UCSC在线数据库分析发现GM13133存在于不同物种中,具有较高的保守性。基于lncRNA具有调节毗邻基因表达的顺式作用(位于PRDM16第一个内含子),我们推测GM13133可能具有促进脂肪能量代谢即棕色化的效应。GM13133在脂肪组织或脂肪细胞中功能与机制尚未见报道。为揭示GM13133的潜在功能,我们首先采用慢病毒表达系统建立GM13133稳转白色脂肪细胞,检测其对脂肪细胞分化的影响。结果发现过表达GM13133并不影响白色脂肪细胞增殖;但可显著下调分化相关基因的mRNA和蛋白的表达;经油红O检测发现过表达GM13133可以显著降低脂滴的数量和大小;甘油三酯检测验证过表达GM13133组的甘油三酯量也显著下调。以上提示过表达GM13133可以抑制白色脂肪分化,有望为人类肥胖防治提供潜在新靶标。检测还发现白色脂肪细胞过表达GM13133后UCP-1、PGC1-Ω表达的显著增加,线粒体拷贝数明显增多,耗氧率也明显升高,呈现类棕色脂肪细胞样的特征。我们进一步探讨GM13133促棕色化机制发现,GM13133过表达并没有改变其潜在靶标PRDM16含量的改变,因此我们进一步采用RNA测序技术寻找GM13133调控白色脂肪棕色化的机制线索,分析发现GM13133可能通过cAMP信号通路来发挥功能。进一步揭示白色脂肪向棕色脂肪转化的分子机制、寻找促进白色脂肪向棕色脂肪转化的新分子或新药物,有可能为肥胖治疗带来光明的前景。第一部分GM13133的发现与基本生物学特征目的:对GM13133进行保守性和同源性分析,了解LncRNA--GM13133在小鼠白色脂肪及棕色脂肪的表达特征,探讨GM13133与脂肪细胞分化和白色脂肪棕色化的相关性,为阐明GM13133在脂肪组织中作用提供理论和实验基础。方法:采用UCSC检索GM13133的序列特征,分析其物种保守性;选择小鼠腹股沟白色脂肪组织、小鼠肩胛处棕色脂肪组织,采用Realtime PCR技术检测GM13133在白色脂肪组织、肩胛处棕色脂肪组织中的表达水平;活体水平寒冷、β3肾上腺素受体激动剂CL-316,243刺激小鼠白色脂肪组织以及细胞水平CL-316,243和db-cAMP处理诱导分化成熟的脂肪细胞,检测刺激后GM13133的表达。结果:1)GM13133具有较高的物种保守性,预测潜在靶基因PRDM16与棕色脂肪细胞分化、生热功能密切相关。2)GM13133在小鼠棕色脂肪组织中呈高表达模式;3)活体水平寒冷、β3肾上腺素受体激动剂刺激可以促进GM13133在白色脂肪中的表达;4)细胞水平CL-316,243和db-cAMP处理诱导分化成熟的脂肪细胞可以促进GM13133的表达。结论:生物信息学分析发现GM13133的物种保守性较好;通过检测小鼠不同组织中的GM13133表达,发现GM13133在棕色脂肪组织中高表达;促棕色调控因素(寒冷刺激、β3肾上腺素受体激动剂)可促进白色脂肪组织和原代培养的细胞中GM13133的表达,机体可能通过促棕色化调控因素调控GM13133的表达来发挥功能。这为后续进行GM13133在白色脂肪棕色化中的功能和机制研究奠定了理论和实验基础。第二部分GM13133抑制白色脂肪分化功能和分析目的:通过在小鼠白色脂肪前体细胞中过表达GM13133,探讨GM13133对小鼠腹股沟处白色脂肪细胞增殖和成脂分化的功能。方法:采用GM13133过表达的慢病毒载体,感染小鼠腹股沟来源的皮下白色脂肪前体细胞,并以转染空载病毒的相同细胞为对照组,实时定量细胞增殖检测仪检测过表达病毒对脂肪前体细胞的增值影响;胰岛素、地塞米松、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌吟(MIX)方案诱导细胞分化成熟;油红O观察其成脂分化过程中脂滴形成情况;酶比色法检测成熟脂肪细胞中的甘油三酯含量;采用Realtime PCR及Western Blot技术,检测脂肪细胞分化关键基因(PPARy、C/EBPβ、FABP4和GLUT4)的表达变化。结果:1)细胞增殖仪检测发现过表达病毒对脂肪前体细胞的增值没有影响;2)经油红O检测发现,过表达GM13133可减少白色脂肪细胞脂滴含量;3)经甘油三酯检测试剂盒检测提示:甘油三酯合成显著下降;4)Realtime PCR技术检测指出脂肪细胞分化关键基因PPARy、C/EBPβ、FABP4和GLUT4的mRNA及其蛋白水平的表达显著下调。结论:过表达GM13133不影响白色脂肪前体细胞的增值,但可抑制白色脂肪细胞脂滴数量和甘油三酯含量;下调小鼠白色脂肪成脂分化相关mRNA和蛋白的表达,该结果表明GM13133可抑制白色脂肪细胞分化。第三部分GM13133促进白色脂肪棕色化功能和分析目的:探讨过表达GM13133后促白色脂肪细胞棕色化的功能和机制。方法:采用GM13133过表达的慢病毒载体,感染小鼠腹股沟来源的皮下白色脂肪前体细胞,并且以空载病毒组做对照组,胰岛素、地塞米松、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)方案诱导细胞分化成熟;Realtime PCR和电镜检测对照组与过表达组中线粒体表达差异;免疫荧光检测UCP-1表达差异;Seahorse检测耗氧率的差异;Realtime PCR和WesternBlot检测棕色脂肪细胞特异性基因、棕色化相关基因、预测潜在靶基因PRDM16的表达变化;RNA-seq技术分析过表达GM13133与对照组中调控的基因及相关信号通路的差异。结果:1)Realtime PCR及电镜分析发现过表达GM13133组中线粒体拷贝数明显上调;2)免疫荧光检测提示过表达GM13133后UCP-1表达量显著高于对照组;3)Seahorse检测发现db-cAMP刺激前后过表达GM13133组耗氧率均明显高于对照组;4)Realtime PCR及Western Blot检测白色脂肪细胞棕色化关键基因的mRNA及蛋白水平揭示在过表达GM13133组显著上调;5)Realtime PCR和Western blot检测发现GM13133的下游靶标PRDM16在过表达组与对照组之间并没有明显的差异,6)RNA-seq技术分析发现对照组与过表达GM13133组中1.5倍差异的基因共有523个,并且P值都小于0.05,其中包括217个上调的基因和306个下调的基因,其中cAMP信号通路表达差异最明显。结论:1)GM13133上调了白色脂肪生热相关指标以及棕色化关键基因的mRNA和蛋白水平;2)GM13133调控白色脂肪棕色化不是通过调控临近基因PRDM16发挥作用的3)RNA-seq技术分析预测过表达GM13133组中其产热变化的信号通路可能是cAMP信号通路。综上结果表明GM13133可以促进白色脂肪棕色化及能量消耗,其机制可能与cAMP信号通路相关。