种质资源是培育植物新品种的先决条件。近年来的工业化、城市化及气候变暖使全球约1/3的植物种类面临生存的威胁。种质资源的保存已成为全球育种科学家关注的重点课题。植物病原体，如病毒、植原体等是阻碍农业生产持续发展的重要因素。栽培无毒苗是目前生产上防治病原体的有效方法，无毒苗的生产是实现无毒化栽培的核心技术。超低温保存是长期保持种质资源的最理想方法。超低温疗法具有脱毒率高、不受茎尖大小影响、容易操作等优点，正在发展成为一种新的脱毒生物技术。本研究以菊花（Chrysanthemum morifolium）、枣（Ziziphus jujuba）和马铃薯(Solanum tuberosum)三种无性繁殖的园艺植物为试材，建立了高效、广谱的茎尖超低温保存体系，并利用超低温疗法有效地脱除了两种病原体：菊花B病毒（Chrysanthemum virus B, CVB）和枣疯病植原体（Jujube withches’broom phytoplasma，JWB）。研究结果如下：1.菊花小滴玻璃化超低温保存体系的建立及CVB的脱除。以‘日本红’为试材，通过优化关键因素，建立的超低温保存体系是：从6周苗龄的母株上分别截取3-7节位的茎段（0.5cm），在MS培养基上光照培养12d，从伸长的腋芽上剥取2.0mm（5-6片叶原基）的茎尖，MS+0.5M蔗糖的培养基预培养1d，MS+2M甘油+0.4M蔗糖室温加载茎尖20min，0oC条件下PVS2处理茎尖30min，在铝箔条（2x0.8cm）上用PVS2（2.5μL）形成一个个小滴，茎尖逐个放入小滴中，将带有茎尖的铝箔条直接投入液氮保存1h，保存后将铝箔条迅速转入MS+1.2M蔗糖的卸载液中处理20min，茎尖在MS+0.05mg L-1GA3再生培养基上黑暗培养3d，再转至新鲜的相同培养基上，正常光照条件下培养。建立的超低温保存体系用于测试其它5个基因型，6个基因型的平均成活率和再生率分别是84.7%和68.5%，再生率最高的是‘日本红’（83.6%），最低的是‘西子秋妆’（43.2%）。通过组织学观察‘日本红’和‘西子秋妆’超低温保存后茎尖的成活细胞的分布，结果表明，两个基因型的成活细胞模式和数量相似，顶端分生组织和第1-3片叶原基细胞能成活，而茎尖基部和第4-6片叶原基的细胞死亡。SSR （simplesequence repeats，简单序列重复）和FCM（flowcytometry，流式细胞术）对两个基因型再生植株的检测结果表明，再生植株未出现变异性条带和倍性变异。超低温疗法对CVB有一定的脱除率，0.5-2.0mm的茎尖的脱毒率为21.9%-30.8%。茎尖培养（0.5-2.0mm）均不能脱除CVB。利用免疫组织化学法观察CVB在茎尖中的分布，CVB在茎尖中有两种分布情况：40%茎尖的顶端分生组织及第1-2片叶原基没有CVB分布，60%茎尖的顶端分生组织和第1-2片叶原基有CVB分布。超低温处理茎尖的成活细胞分布和病毒定位解释了超低温疗法脱除CVB的机理。2.‘骏枣’茎尖小滴玻璃化结合微型嫁接的超低温保存体系的建立及枣疯病植原体的脱除。建立的超低温保存体系是：从6周苗龄的感染枣疯病植原体的‘骏枣’上切取顶芽，剥取1.0mm（5-6片叶原基）的茎尖，MS+0.5M蔗糖的培养基预培养1d，MS+2M甘油+0.4M蔗糖室温加载液处理20min，0oC条件下PVS2处理茎尖30min，铝箔条（2x0.8cm）上用PVS2溶液（2.5μL）形成一个个的小滴，茎尖逐个放入小滴中，将带有茎尖的铝箔条直接投入液氮保存1h。保存后，将铝箔条迅速放入MS+1.2M蔗糖的卸载液处理20min，茎尖在MS+0.5mg L-1BA+0.1mg L-1IBA再生培养基上黑暗培养3d，转到新鲜的相同再生培养基上光照培养4d，超低温保存后成活的茎尖嫁接到酸枣（Ziziphus spinosa）实生苗的L型接口上，正常光照条件下培养。超低温保存后的茎尖成活率为85%，嫁接后的再生率为75%。0.2mm（1-2片叶原基）、0.5mm（3-4片叶原基）和1.0mm（5-6片叶原基）的茎尖经过超低温保存后均能100%的脱除植原体。在对照（不经过超低温保存，直接微型嫁接）中，0.2mm的茎尖能100%的脱除植原体，0.5mm的茎尖仅有7%的脱除率，1.0mm的茎尖完全不能脱除植原体。细胞超微结构和组织学观察结果表明，茎尖顶端分生组织及第1-2片叶原基的细胞体积小（24.7μm2）、总液泡体积小（0.5μm2）、核质比大（1.1），超低温保存后所受到的伤害小，能存活；茎尖基部和第3-4片叶原基的细胞体积是顶端分生组织的2-3倍（48.4-63.7μm2）、总液泡体积是顶端组织的9-89倍（4.5-44.7μm2），核质比更小（0.18-0.5），超低温保存后所受到的伤害大，不能存活。电镜结果表明，顶端分生组织及第1-2片叶原基细胞中没有植原体的分布，在茎尖基部及第3片和其他叶原基中有明显分布。因此，茎尖超低温处理后再生植株是健康的。FCM对脱毒再生植株的检测结果表明，再生植株未发生倍性变异。3.中国马铃薯茎尖包埋玻璃化超低温保存体系的建立。以‘紫花白’为试材，通过优化关键因素，建立的超低温保存体系是：从3周苗龄的母株上切取0.5cm的茎段，放置于MS培养基上光照培养7d，将萌发的腋芽（1-1.5cm）放到5oC黑暗条件下培养3周，取2mm的茎尖（5-6片叶原基），MS+0.3M蔗糖的培养基预培养1d，茎尖用2.5%（w/v）的硅藻酸钠溶液在0.1M CaCl2溶液形成小球，用MS+2M甘油+0.6M蔗糖的加载液处理小球90min，0oC条件下PVS2处理小球5h，将小球置入1.8mL冷冻管里（内含0.5mL PVS2），直接投入液氮中保存1h，保存后将冷冻管迅速投入水浴（38oC）中解冻2min，将小球转至MS+1.2M蔗糖卸载液中处理20min，再将小球接种到MS+0.5mg L-1IAA+0.5mg L-1ZR+0.2mg L-1GA3再生培养基上黑暗培养3d，转到MS+0.8mg L-1ZR+2mg L-1GA3再生培养基上，正常光照条件下培养。建立的超低温保存体系应用于验证其他7个主栽马铃薯基因型的保存效率，8个基因型的平均成活率和再生率分别为77.3%和41.2%。通过组织学观察超低温保存茎尖的成活细胞分布，结果表明，顶端分生组织及第1-3片叶原基细胞成活，其他部位的细胞死亡。ISSR（inter-simple sequencec repeats，内部简单序列重复）和FCM对超低温保存再生植株的检测结果表明，再生植株未出现变异性条带和倍性变异。茎尖超低温保存体系的建立为菊花、枣和马铃薯超低温基因库的建立提供了技术支撑，超低温疗法脱毒为无毒苗的生产提供了新途径。