【摘 要】
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核苷三磷酸(NTP)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)不仅是重要的生化物质,也广泛应用于医药、食品和科学研究。本文中联合利用冰核蛋白(INP)进行细胞表面展示的核苷酸激酶(INP-N-NMKase
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核苷三磷酸(NTP)和脱氧核苷三磷酸(dNTP)不仅是重要的生化物质,也广泛应用于医药、食品和科学研究。本文中联合利用冰核蛋白(INP)进行细胞表面展示的核苷酸激酶(INP-N-NMKase)与乙酸激酶(INP-N-ACKase)的多酶合成体系,由核苷酸或脱氧核苷酸(NMP/dNMP)一步式生成NTP/dNTP,其中,偶联了 ACKase/ACP催化的磷酸供体ATP循环再生体系。通过ATP的循环再生,反应起始只需要添加少量(底物浓度1/20,UMP反应时需添加1/5)ATP即可满足反应需求。将来自保加利亚乳杆菌的核苷酸激酶nmk(包括cmk、amk、tmk和umk)基因片段和乙酸激酶ack基因片段分别插入到含有冰核蛋白N端基因inp-n的质粒pET-28a(+)下游,构建表面展示菌E-INP-N-NMK和E-INP-N-ACK,导入到大肠杆菌进行表达。以完整细胞作为催化剂,5mM底物的反应体系中,CTP、dCTP转化率分别为96%、93%,ATP、dATP转化率均达到96%,dTTP转化率为90%,UTP转化率为80%,反应过程中无明显产物降解。表面展示的融合蛋白在37℃下温育,尤其在底物存在下,稳定性得到显著提升,不亚于甚至优于胞内游离酶。并且由于整细胞的特性,通过离心回收重复利用可达8次以上。
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