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表皮生长因子(EGF)介导的信号通路可以参与细胞增殖、分化、迁移等细胞活动,还可促进肿瘤发生。本试验利用EGF刺激细胞,对EGF介导的处于细胞分裂期和分裂间期的信号通路中部分重要蛋白的表达进行了研究,获得以下结果:1、用Nocodazole(诺考达唑,200 ng/mL)处理细胞后获得处于分裂间期和分裂期的细胞;然后用EGF(50 ng/mL)刺激细胞后检测不同信号通路上相关信号蛋白的磷酸化水平发现:EGF刺激的EGFR酪氨酸激酶磷酸化水平在分裂期高于分裂间期;当细胞停止于分裂期(G2/M期)时,EGFR激活的MAPK通路、PI3K通路和PLC-γ1通路同时被抑制;EGF(50 ng/mL)介导的ERK和AKT磷酸化水平在分裂期显著降低(P<0.05),表明MAPK通路和PI3K通路被显著抑制;此外,EGF(50 ng/mL)介导的FAK和Cortactin磷酸化水平在分裂期下降,而EGF(50 ng/mL)介导的Cbl磷酸化水平在分裂间期和分裂期差异不显著(P>0.05)。2、EGFR及其下游信号蛋白的表达受其抑制剂AG1478、U0126、U73122、Wortmannin等的影响,EGFR及相关信号蛋白的磷酸化被抑制,这种抑制作用还与AG1478的浓度相关。在0.5μmol/L AG1478抑制EGFR磷酸化后发现,EGF(50 ng/mL)介导的Raf、MEK磷酸化水平明显下降;在0.5μmol/L AG1478处理Hela-H2B细胞后ERK磷酸化水平下降,而2.5μmol/L AG1478才能使COS7细胞的ERK磷酸化水平降低;在0.5μmol/L AG1478处理细胞后,EGF(50 ng/mL)介导的AKT、PLC-γ1、Cbl、Cortactin等磷酸化水平都显著下降;10μmol/L U0126可抑制EGF(50 ng/mL)介导的MEK磷酸化;U73122明显降低了EGF(50 ng/mL)介导的PLC-γ1磷酸化水平,尤其是100μmol/L U73122更显著;100 nmol/L Wortmannin显著抑制了EGF(50 ng/mL)介导的AKT磷酸化。3、EGF刺激可以影响信号蛋白ERK的磷酸化水平。在Nocodazole(250 ng/mL)未处理的细胞中,ERK磷酸化水平随时间的延长而下降,在血清饥饿12 h后显著降低(P<0.05);而在Nocodazole处理的细胞中,ERK磷酸化水平有随Nocodazole处理时间延长下降的趋势。细胞经过Nocodazole处理,再用EGF(50 ng/mL)刺激后发现, Nocodazole未处理细胞的ERK磷酸化水平明显上升(P<0.05);而Nocodazole处理细胞的ERK磷酸化被抑制。在Nocodazole处理的细胞中,8 h后用EGF处理发现MEK磷酸化水平低于Nocodazole未处理组;而12 h后Nocodazole处理细胞的EGF介导的ERK磷酸化水平低于Nocodazole未处理组,尤其是24 h后差异显著(P<0.05)。另外发现,EGF作用下的细胞迁移被Nocodazole抑制。4、细胞经过Nocodazole(200 ng/mL)处理后,胞内EGF-EGFR复合物含量明显低于处理组,表明分裂期细胞限制了EGF-EGFR复合物的胞吞作用;通过对EGFR胞吞途径中重要蛋白Clathrin和Caveolin检查,结果证实在EGF刺激下Clathrin表达在分裂间期显著高于分裂期(P<0.05),而Caveolin在分裂期和分裂间期并无明显差异,表明以Clathrin为主的EGFR胞吞途径在分裂期被阻止;对EGFR酪氨酸磷酸化水平的检测结果表明:在酪氨酸链上Y992、Y1045、Y1068、Y1086和Y1173位点磷酸化存在细胞差异性,这种差异性在COS7细胞中分裂期和分裂间期差异不显著(P>0.05);Hela-H2B细胞中,Y992位点磷酸化水平在细胞分裂期高于分裂间期;在Cho-EGFR细胞中,5个位点磷酸化水平在分裂期有高于分裂间期的趋势。另外,Grb2和Shc与激活的EGFR结合能力在分裂期降低,Ras磷酸化在分裂期也被明显的抑制。最后,PMA介导的MEK和ERK磷酸化水平在分裂期下降。以上研究结果表明,MAPK通路在分裂期被阻止。目前的研究结果证实,细胞分裂间期的相关信号通路中蛋白磷酸化水平明显高于分裂期;EGF介导的信号蛋白活性受抑制剂AG1478、U0126、U73122、Wortmannin等的影响;当细胞在进入分裂期后,MAPK通路明显被抑制。