颞下颌关节(temporomandibular joint,TMJ)强直是一种口颌系统中严重影响身心健康的疾病,常可出现张口受限、咀嚼困难等症状。众多致病因素中创伤是导致TMJ强直的最常见因素,但致病机理仍不明确。本课题组经过系列研究,初步证实:翼外肌通过类似于“牵张成骨”的作用参与创伤性TMJ强直的发生,但具体的分子机制不清。本课题依据创伤性TMJ强直的易感因素,首先通过复合创伤模式建立TMJ强直动物模型,然后通过基因芯片技术对创伤性TMJ强直发生过程以及离断翼外肌后表达的基因进行差异分析,选出感兴趣基因后通过RT-q PCR进行验证,以期从分子水平探讨翼外肌在创伤性TMJ强直发生中的作用与我们提出“牵张成骨”的一致性。第一部分创伤性颞下颌关节强直动物模型的建立目的:通过复合创伤模式建立创伤性TMJ强直动物模型,为后期的研究提供基础。方法:9只绵羊,随机抽出1只作为正常对照,其余8只随机分成12周、24周两组(每组4只)。除正常对照外,所有绵羊双侧关节均做建模手术,手术方法为髁突矢状骨折+关节盘外1/4切除+关节窝内做“井”字形深沟。术后12周、24周分别处死对应组的4只动物,通过髁突大体形态观察及螺旋CT扫描观察髁突形态的改变。结果:实验组动物12周时发生纤维强直,24周时发生骨性强直。12周时大体观察可以看到髁突形成了球状复合体,同时球状复合体较正常髁突前后径(1.20±0.10 cm vs 0.45±0.03 cm)及内外径(2.64±0.12 cm vs 1.75±0.03 cm)均增加(P<0.05),绵羊最大张口度(2.48±0.33 cm vs 4.65±0.38 cm)减小(P<0.05),螺旋CT可以看到有新生骨组织和骨吸收的发生;24周时髁突球状复合体更明显,可见骨性粘连,髁突前后径(1.65±0.12 cm vs 1.20±0.10 cm)和内外径(3.55±0.12 cm vs 2.64±0.12cm)均较12周有所增加(P<0.05),绵羊最大张口度与12周相比(1.80±0.16cm vs2.48±0.33 cm)减小(P<0.05),螺旋CT扫描可见关节间隙内大量新生骨组织,呈现高高低低的形态,并且新生的毛糙新骨也伸入到关节间隙内。结论:复合创伤模式可以成功的建立创伤性TMJ强直模型,使髁突区域形成骨性强直。第二部分创伤性颞下颌关节强直相关分子的初步筛选实验一通过基因芯片筛选创伤性颞下颌关节强直相关分子目的:通过高通量基因芯片技术初步筛选出创伤性TMJ强直相关分子。方法:6只绵羊,随机分成4周、12周两组(每组3只),其中每组均有1只正常绵羊(正常组)不进行手术,除正常组绵羊外所有绵羊的手术方式按照左侧髁突(未断翼外肌组)进行第一部分的建模手术,右侧髁突(断翼外肌组)进行建模手术+离断翼外肌。按4周、12周的时间点处死实验动物,切取髁突骨折区骨组织,从中提取RNA进行基因芯片检测,利用聚类热图、散点图、DAVID平台、GO富集分析、功能层次网络构建(GO-network)、Pathway分析等多种手段对芯片结果进行分析,筛选感兴趣分子。结果:4周时,未断翼外肌组上调表达基因多于断翼外肌组和正常组,未断翼外肌中软骨内成骨作用因子、肌肉相关功能因子、破骨作用因子表达为上调,断翼外肌组中软骨内成骨作用因子、破骨作用因子表达为上调,且软骨内成骨作用因子、肌肉相关功能因子、破骨作用因子的表达均弱于未断翼外肌组。12周时,未断翼外肌组上调基因少于断翼外肌组,两组上调基因均多于正常组,未断翼外肌组中肌肉相关功能因子、骨化作用因子、成骨作用因子表达为上调,其中肌肉相关功能因子、成骨作用因子、破骨作用因子的表达高于断翼外肌组。4周组与12周组对比,未断翼外肌组4周时上调基因较多,肌肉相关功能因子随时间推移为减弱的趋势,骨化作用因子为上升的趋势;断翼外肌组12周上调基因较多,成骨作用和骨化作用因子随时间推移为上升的趋势。通过多种方法分析后,初步筛选出感兴趣分子为TGF-β1、COL2A1、OCN、LECT1、BMP7、FOS、CALCR、IL1A、COMP、CLEC3A。结论:翼外肌的牵张作用可促进创伤性TMJ强直中骨折区域成骨相关分子的表达,且表达与牵张成骨相似;离断翼外肌可降低髁突区域的骨相关分子前期的表达,分子表达与常规骨折愈合相似;TGF-β1、COL2A1、OCN、LECT1、BMP7、FOS、CALCR、IL1A、COMP、CLEC3A等骨相关分子可能在创伤性TMJ强直中发挥作用。实验二RT-q PCR验证创伤性TMJ强直部分相关分子目的:通过RT-q PCR验证实验一初步筛选出的创伤性TMJ强直相关分子。方法:10只绵羊,随机分成4周、12周两组(每组5只),每组均有1只正常绵羊不进行手术,动物模型制备同实验一。术后4周、12周分别处死对应分组5只绵羊,通过RT-q PCR检测BMP7、CALCR、FOS、LECT1 4个基因在各组中的表达水平。结果:BMP7和LECT1在各组中的表达情况与基因芯片结果一致。CALCR仅在4周组内比较的表达情况与芯片完全一致。FOS在4周和12周间比较的表达情况与芯片完全一致。结论:未断翼外肌组的成骨分子表达趋势与牵张成骨一致性较高,断翼外肌组的成骨分子表达趋势与常规骨折一致性较高。说明翼外肌对髁突骨折断端的牵拉起到了类似牵张成骨的作用,使骨折区出现过度成骨现象,导致了TMJ强直的发生。