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背景皮肤恶性黑色素瘤（Skin Cutaneous Melanoma,SKCM）恶性程度高,易早期发生淋巴结及血行转移,临床预后不佳,探索能够评估黑色素瘤患者预后的标志物是十分必要的。免疫检查点抑制剂疗法已成为晚期不可切除Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤患者的标准治疗选择。目前许多研究证实了免疫检查点抑制剂疗法效果显著,但在临床应用中仍有近50%患者对该治疗无反应或长期用药后有效性降低,这可能是由于肿瘤微环境中自身的免疫抑制特性,导致细胞毒性T细胞浸润降低,Treg细胞数量增加,从而导致对免疫治疗的原发性或获得性抵抗。因此联合其他治疗方式（比如肿瘤疫苗等）,有效地激活淋巴细胞的抗肿瘤作用,减弱免疫耐受,提高治疗有效率,是一种可探讨的治疗方式。黑色素瘤中因大量基因发生突变,可能产生较多的肿瘤相关抗原和新抗原,可作为免疫治疗的靶点。糖蛋白100（glycoprotein 100,GP100）,是一种由黑色素细胞、色素沉着的视网膜细胞和大多数黑色素瘤细胞表达的非突变“自身”抗原,在其他正常组织或非黑素瘤肿瘤中不表达,与正常黑色素细胞相比,其在黑色素瘤进展的各个阶段均会过度表达,是恶性黑色素瘤的肿瘤相关性抗原（tumor associated antigen,TAA）之一。那GP100的表达是否与SKCM患者预后、临床病理因素及肿瘤免疫细胞浸润水平相关?本文首先从GP100的基因和蛋白表达水平分析其与临床预后的关系,探讨相关的临床病理因素。同时,基于公共数据库进一步论证分析了 GP100与淋巴细胞的免疫浸润水平的相关性。GP100作为黑色素瘤免疫治疗的重要靶点之一。抗原特异性CD8+T细胞在清除肿瘤细胞过程中发挥重要作用,肿瘤疫苗可以通过诱导初始T细胞分化为效应细胞或扩增体内预先存在的抗原特异性CD8+T细胞而清除肿瘤细胞,是黑色素瘤免疫治疗的策略之一。Robert Schreiber等人提出的“免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸”的免疫编辑理论揭示了肿瘤细胞在被免疫清除的同时,随时产生新突变,逃逸免疫系统的清除作用。针对某一特定靶抗原的肿瘤疫苗所诱导产生的特异性CD8+T细胞,将难以有效清除肿瘤细胞,这是目前肿瘤疫苗临床应用中遇到的瓶颈。抗原表位扩展是指机体免疫系统诱导产生针对病原体等免疫靶抗原的特异性应答过程中,相继产生的针对抗原其他表位的免疫应答,可克服因肿瘤细胞异质性引起的免疫逃逸现象,增强机体抗肿瘤作用。但引起抗原表位扩展现象的疫苗特征及相关作用机制并不清楚。诱导机体产生抗原特异性CD8+T细胞过程中需要专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）对外源性抗原进行摄取、加工并以主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）-I/多肽复合物的形式提呈给 CD8+T 细胞,诱导细胞免疫。现有研究显示,传统Ⅰ型树突状细胞（Conventional Type 1 Dendritic Cell,cDC1）被认为具有最强大的抗原交叉提呈能力,是肿瘤疫苗设计与研究中的重要考量因素。cDC1细胞表面选择性表达X-C基序趋化因子配体1（X-C Motif Chemokine Ligand 1,XCL1）的受体---X-C 基序趋化因子受体 1（X-C Motif Chemokine Receptor 1,XCR1）。我们以GP100为模式抗原,旨在构建一种能扩展T细胞抗原识别表位的肿瘤疫苗,诱导机体产生免疫级联反应,增强抗肿瘤作用。因此,本研究构建靶向cDC1的XCL1/GP100融合蛋白,拟分析具有次级淋巴组织靶向性的XCL1/GP100融合蛋白诱导产生针对免疫抗原GP100的特异性细胞免疫的抗肿瘤保护作用,以及对抗原表位的扩展作用及机制。期望相关研究结果可以为改善肿瘤患者免疫治疗效果提供理论依据。目的探讨GP100在SKCM中的表达情况及其与临床病理因素的相关性,并研究其作为黑色素瘤预后肿瘤标志物的可行性（第一部分）。GP100经常被用作SKCM过继性T细胞治疗的靶抗原,免疫浸润水平往往是影响SKCM患者预后生存的重要因素,因此我们试图探究GP100与SKCM患者体内的免疫浸润水平的相关性（第二部分）。肿瘤疫苗通过刺激机体免疫反应进而增强现有的抗肿瘤反应或激发原始T细胞,从而激发患者的效应T细胞功能,进而杀伤肿瘤细胞。在本研究中,我们以GP100为模式抗原,旨在构建一种能扩展T细胞抗原识别表位的肿瘤疫苗,诱导机体产生免疫级联反应,增强抗肿瘤作用,我们试图探讨XCL1/GP100融合分子在SKCM中的抗肿瘤效应及作用机制（第三部分）。方法第一部分从TCGA数据库中下载了 350例SKCM患者的GP100基因表达数据以及相对应患者的临床资料和预后数据,并从GTEx数据集中收集正常皮肤的GP100基因表达数据。同时免疫组化分析订制的50例含预后信息的SKCM患者的组织微芯片中的GP100蛋白表达量。分析GP100基因及蛋白表达与临床病理特征的相关性,以及与预后的关系。第二部分本研究借助 TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）和 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）在线数据库进一步分析了 GP100 在 SKCM及多种肿瘤中的表达差异。进一步借助GEPIA、PrognoScan评估了 GP100对SKCM预后总生存的影响。在TIMER以及GEPIA数据库中,我们进一步分析了 GP100表达与肿瘤免疫细胞及免疫浸润水平的基因标志物之间的相关性。第三部分本研究将趋化因子XCL1的羧基端与经过突变后的GP100的氨基端相连接构建了 XCL1/GP100融合分子（DNA核酸疫苗）,该分子经基因枪注射于皮下成瘤周边区域,观察其对小鼠生存的影响及探讨其可能的相关机制。该研究主要分为以下几个步骤:1)构建表达XCL1/GP100、GP100的质粒;2)B16-ova成瘤实验探索;3)探究XCL1/GP100对黑色素瘤的生长及生存期的影响（C57小鼠）;4)探究XCL1/GP100对pre-existT细胞的扩增作用（PMEL小鼠）;5)探究XCL1/GP100免疫条件下是否可诱导出抗肿瘤的免疫级联反应;6)探究XCL1/GP100和PD-1联合应用在抗黑色素瘤中的应用价值。结果第一部分1.350例TCGA以及50例TMA中SKCM患者数据分析均证实GP100在SKCM中呈高表达状态。2.TCGA数据的Cox多因素回归分析发现,GP100表达（P=0.002）、年龄（P=0.039）以及瘤荷（P＜0.0001）是影响SKCM患者预后生存的独立危险因素。3.TMA数据的Cox多因素回归分析发现,GP100蛋白表达强度（P=0.002）、远处转移（P=0.002）以及AJCC分期（P＜0.0001）是影响SKCM患者预后生存的独立危险因素。4.TMA分析证实GP100表达与SKCM患者的Clark分级、溃疡和AJCC分期显著相关（均P＜0.05）。5.在以上两组研究中,GP100是影响黑色素瘤患者预后生存一致的独立危险因素（P 均为 0.002）。第二部分1.基于GEPIA数据库分析了 TCGA和GTEx中的数据,发现SKCM（461个样本）中GP100的表达水平显著高于正常组织（558个样本）,具有统计学差异（P＜0.05）。2.TIMER以及GEPIA数据库证实高表达的GP100往往预示着SKCM患者预后较差,这些结果表明GP100可作为SKCM患者的预后标志物。3.TIMER数据库分析证实GP100表达与肿瘤免疫细胞的免疫浸润水平的基因标志物之间呈明显负相关。第三部分1.成功构建了 XCL1/GP100融合分子及XCL1/mCherry融合指示分子。2.XCL1/GP100融合蛋白可有效趋化至人的XCR1+CD141+DC细胞。3.XCL1融合蛋白能有效促进原住型CD8+DC摄取抗原。4.在黑色素瘤小鼠种植瘤模型中,XCL1/GP100可有效抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。5.XCL1/GP100融合分子可诱导产生针对非免疫靶抗原的特异性细胞免疫,扩展T细胞抗原识别表位。6.XCL1/GP100融合分子可增强PD-1抗体的抗黑色素瘤作用。结论1.SKCM患者GP100高表达时往往提示预后不佳,因此GP100可作为SKCM患者的预后肿瘤标志物。高龄（＞60岁）、远处转移、AJCC分期（Ⅲ/Ⅳ）以及瘤荷状态也预示着黑色素瘤患者预后较差。2.GP100高表达往往提示患者体内CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞浸润水平偏低,GP100表达与肿瘤免疫细胞及免疫浸润水平的基因标志物之间呈明显负相关。3.相较于单纯的GP100,XCL1/GP100融合蛋白能有效趋化人CD141+DC细胞,这表明融合蛋白仍保持有XCL1的趋化活性,保证融合蛋白能够靶向表达XCR1的专职抗原交叉提呈细胞CD141+DC。4.XCL1融合蛋白有效促进抗原持续、大量的进入局部引流淋巴结,并被CD8+DC细胞摄取,这有利于抗原交叉提呈和致敏na?ve CD8+T细胞。5.在黑色素瘤小鼠种植瘤模型中,XCL1/GP100融合分子可有效抑制小鼠黑色素瘤的生长并延长小鼠生存期。XCL1/GP100融合分子在发挥抗肿瘤免疫反应时既能诱导从头产生的抗肿瘤免疫应答,又能扩增机体内预先存在的抗肿瘤反应,发挥抑制肿瘤生长的作用。6.XCL1/GP100抗黑色素瘤DNA疫苗不仅能诱导机体产生针对免疫靶抗原GP100的特异性细胞免疫,而且可诱导产生针对非免疫靶抗原OVA的特异性细胞免疫,扩展T细胞抗原识别表位,进而增强肿瘤的杀伤效果。7.相较于单一的XCL1/GP100或者PD-1抗体,XCL1/GP100联合PD-1抗体,可明显减缓肿瘤生长速度,延长小鼠生存期。证明XCL1/GP100融合分子可显著增强PD-1抗体的抗肿瘤作用。