第一部分HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤是脊柱骨折脱位的严重并发症,常导致损伤节段以远感觉、运动及其他躯体功能严重障碍,不仅给患者的身心造成巨大的影响,还会对其家庭及社会带来沉重的负担。目前,临床上还没有找到一种令人满意的方法来治疗或治愈此疾病。间充质干细胞(MSCs)属于多能干细胞,具有自我复制及多向分化潜能。MSCs能分泌多种神经营养因子和细胞因子,具有免疫调节,抗细胞凋亡和抗炎作用,能够促进神经细胞的存活及再生。神经干细胞(NSCs)是能够自我复制及具有多种神经细胞分化潜能的干细胞,能够促进脊髓损伤后受损的神经通路的修复重建。但由于受到损伤脊髓局部炎性环境的影响,移植的NSCs存活率较低。有研究表明,MSCs可以调节NSCs生长的微环境,提高其存活率。此外,许多研究指出,MSCs可以减少与干细胞移植相关的肿瘤形成。我们应用hUC-MSCs与hNSCs联合移植治疗大鼠脊髓损伤,经查阅国内外文献,未见有报道。本研究旨在找寻治疗脊髓损伤更为有效的方法及探索其内在机制,为将来hUC-MSCs与hNSCs的临床应用垫定基础。研究目的(1)研究hUC-MSCs与hNSCs联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用。(2)研究hUC-MSCs与hNSCs单独移植修复大鼠脊髓损伤的作用及对二者进行比较研究。(3)通过免疫组化、免疫荧光、Elisa实验、LFB-CV染色等方法来研究探索hUC-MSCs与hNSCs移植修复大鼠脊髓损伤的作用机制。研究方法(1)HUC-MSCs的分离、培养及鉴定新鲜脐带于孕38～40周的健康产妇剖宫产术中获取。我们应用组织块贴壁法培养hUC-MSCs。将自脐带分离的华通胶切成细小碎块后,转入细胞培养瓶中,在添加有相应添加剂的DMEM完全培养基中培养。在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养7～10天后,吸除组织块,重铺贴壁细胞,每3天换液1次。细胞经传代后,收集第3～5代细胞用于移植实验。以流式细胞仪鉴定细胞表面特异标志物;细胞经成骨成脂诱导分化后,应用茜素红S染色及油红0染色鉴定其分化能力。(2)HNSCs的分离、培养及鉴定我们采用常规人工流产的8～10周龄胚胎来获取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在5%CO2的培养箱中37℃下培养。每周2次换液,7～10天便可形成神经球。细胞经传代后,获取第3～5代NSCs备移植用。同时应用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞特异性标志物;细胞经诱导分化后,以抗β-tubulinⅢ与抗GFAP抗体通过免疫荧光鉴定其分化能力。(3)实验分组、脊髓损伤模型制作及细胞移植本研究采用NYU撞击器对成年雌性Wistar大鼠建立中度脊髓挫伤模型。造模后第二天BBB评分≤2的大鼠被选用。本实验共选取了 108只脊髓损伤大鼠进行研究,随机分为以下五组:1)hUC-MSCs组;2)hNSCs组;3)hUC-MSCs+hNSCs组;4)PBS组(对照组);5)Sham组(假手术组)。我们在大鼠脊髓损伤1周后于T10节段行干细胞髓内注射移植治疗。(4)指标检测在大鼠SCI之前和之后1天用BBB评分法对所有动物进行评估,然后每周一次直至实验结束。细胞移植后2周,处死部分大鼠并提取脊髓组织,行冰冻切片,进行免疫荧光和免疫组织化学检测,观察及评估移植干细胞的存活、分化及受损脊髓BDNF的表达。细胞移植后2周处死部分大鼠,提取新鲜脊髓组织行脊髓匀浆,以夹心ELISA法检测BDNF的表达。在大鼠SCI造模后第8周,将实验动物处死并提取脊髓组织,行石蜡切片,进行Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,检测脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的数量。研究结果(1)细胞培养及鉴定我们以组织块贴壁培养方法从脐带华通胶基质中成功分离培养出hUC-MSCs。获取的第三代细胞经流式细胞仪检测其表面标志物,结果为高表达CD44,CD90,CD105,而CD34和CD45则表达阴性。经成骨与成脂培养基诱导分化后,茜素红S染色及油红0染色均为阳性结果,表明其具有成骨及成脂分化能力。我们通过从常规人工流产的胚胎前脑组织中成功分离和培养出hNSCs。其细胞标志物Nestin和SOX2免疫荧光染色阳性。经诱导分化后,免疫荧光结果显示β-tubulinⅢ与GFAP抗体染色阳性,证实其具有分化为神经元及星形胶质细胞的能力。(2)BBB评分结果自大鼠SCI后第2周至实验结束,hUC-MSCs+hNSCs组BBB评分明显高于其他3个治疗组,结果存在显著统计学差异。自大鼠SCI后4周开始,hNSCs组评分高于PBS组,其差异具有统计学意义(P<0.05),并持续至试验结束。在大鼠SCI后第5周,hUC-MSCs组的BBB评分迅速增加,与PBS组相比有显着差异,并且这种趋势一直持续到第8周(P<0.01)。在整个实验过程中,hUC-MSCs组大鼠的BBB评分与hNSCs组相比,差异无统计学意义。(3)干细胞的存活与分化关于细胞移植后2周所移植干细胞存活的计数,hUC-MSCs+hNSCs组明显高于hNSCs组(P<0.05)和hUC-MSCs组(P<0.01)。在PBS组(阴性对照组)中未发现有HuNu 阳性细胞。hUC-MSCs组与hNSCs组相比,差异无统计学意义。在 hUC-MSCs 组中,未观察到 HuNu-GFAP、HuNu-β-tubulinⅢ 或 HuNu-CNP抗体双标阳性的细胞,说明所移植存活的干细胞未向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化。而在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中均可观察到上述双标阳性细胞,表明此2组中所移植的干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。根据免疫荧光图像,我们还可以观察到存活的hUC-MSCs分布比较集中,大部分位于注射移植点附近,与宿主组织未能很好的整合;但在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中,所移植干细胞比较分散,游走距离较远,与宿主组织整合较好。(4)BDNF免疫组化及ELISA检测结果干细胞移植2周后受损脊髓组织BDNF免疫组化表达结果为:三个干细胞移植组较PBS组明显增高,其差异具有统计学意义(PBS组vs hUC-MSCs+hNSCs组,P<0.01;PBS组vs hUC-MSCs组与hNSCs组,P<0.05)。但在三个干细胞移植组两两之间,差异无统计学意义。脊髓组织匀浆的BDNF表达ELISA检测结果与免疫组织化学结果一致。(5)脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的检测结果在大鼠SCI后第8周,我们行脊髓横切面Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,结果显示4个脊髓损伤组的脊髓横切面可见大量坏死细胞碎片,轴突退变和空洞。各组髓鞘染色的IOD值,三个干细胞移植组均较PBS组高,差异具有统计学意义(PBS 组 vs hUC-MSCs+hNSCs 组,P<0.01;PBS 组 vs hUC-MSCs 组与hNSCs 组,P<0.05)。hUC-MSCs+hNSCs 组髓鞘染色 IOD 值最高(hUC-MSCs+hNSCs组 vs UC-MSCs 组,P<0.01,hUC-MSCs+hNSCs 组 vs hNSCs 组,P<0.05)。三个干细胞移植组脊髓灰质前角中运动神经元的数量显著高于PBS组(hUC-MSCs+hNSCs 组与 hUC-MSCs 组 vs PBS 组,P<0.01;hNSCs 组 vs PBS组,P<0.05)。三个干细胞移植组与假手术组相比,其脊髓前角运动神经元数量均明显减少(P<0.01),但此三组两两之间无统计学差异。研究结论(1)本研究表明,hNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs在大鼠脊髓损伤亚急性期局部髓内移植均能够促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,且联合移植组效果更佳。(2)联合移植hNSCs和hUC-MSCs可以促进所移植干细胞的存活。(3)HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs三种细胞移植方法均能促进脊髓损伤瘢痕周围BDNF的分泌。(4)HUC-MSCs单独移植后于体内未分化为神经谱系细胞,hNSCs则在移植后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。(5)HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs移植均能够增加受损脊髓髓鞘的数量及脊髓前角运动神经元的数量。联合移植对增加髓鞘数量的作用效果最显著。第二部分HNSCs联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤(SCI)是指由于脊髓组织受到各种损伤因素的破坏,导致躯体神经功能发生暂时或永久性的改变。脊髓一旦严重损伤,修复将十分困难。关于脊髓损伤的治疗主要集中在两个方面,神经保护与神经再生。神经保护能够防止或减缓神经损伤后继发性损害,而神经再生则旨在恢复中断的神经通路,恢复神经功能。目前,干细胞移植是脊髓损伤治疗的研究热点。由于干细胞可以分化成脊髓损伤后所缺失的多种类型的细胞,而且还能够分泌多种营养因子,调节损伤局部炎性反应,干细胞移植成为将来修复受损脊髓缺失组织和促进神经保护和神经再生十分有前景的方法。而NSCs,作为神经再生的种子细胞,更具有其独特的优势。脊髓损伤破坏了大脑和身体之间的通信,导致大脑失去了对完整躯体神经肌肉系统的控制。目前研究者已经开发了许多神经假体,以通过中枢和外周神经系统的功能性电刺激(FES)来恢复部分躯体功能,并能够加强肌肉强度及减轻其萎缩。研究发现,电刺激的作用并非局限于此,受损脊髓部位局部的电刺激,还具有改善局部血液循环,抵消局部内生电流,维持细胞膜的稳定性,激活内源性神经再生等功能。由于脊髓损伤的病理生理过程复杂,靠单一的治疗方式,很难有满意的疗效。而联合多种方法治疗,是目前修复脊髓损伤的一个趋势。我们已有前期研究证实,MSCs联合电刺激治疗脊髓损伤比单独行细胞移植或电刺激效果更好。关于hNSCs联合电刺激治疗脊髓损伤,目前国内外还未有研究报道,我们进行此项研究,旨在寻求更好的治疗脊髓损伤的方法及探索其作用机制,为将来治疗甚至治愈脊髓损伤垫定基础。研究目的(1)研究hNSCs移植联合电刺激对大鼠脊髓损伤的治疗作用。(2)探索hNSCs移植、电刺激分别对大鼠脊髓损伤的治疗作用及对二者进行比较研究。(3)通过免疫组化、免疫荧光、组织western blot等方法探索hNSCs及电刺激对脊髓损伤修复的病理生理机制。(4)探索电刺激对所移植的hNSCs在损伤脊髓局部存活、向神经元分化等生物学行为的影响。研究方法(1)hNSCs的分离、培养我们选择常规人工流产的8-10周龄胚胎来提取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养。每周2次换液。7-10天便可形成神经球,细胞经传代后,获取第3-5代NSCs备用。(2)动物分组、脊髓损伤动物模型制作、细胞移植及电刺激我们于大鼠胸10水平以NYU脊髓打击器建立大鼠SCI模型。选取SCI造模成功的成年雌性Wistar大鼠共100只。随机分为4组,分别为hNSCs组,ES组,hNSCs+ES组及PBS组(对照组),每组25只大鼠。在SCI模型建成1周后行刺激电极安装固定手术及hNSCs移植手术。自安装刺激电极后第二天开始,电刺激组给予电刺激干预,每日2次,直至造模后第10周实验结束。(3)指标检测在大鼠SCI之前和之后1天及之后每周进行后肢运动功能BBB评分至第10周实验结束。实验结束时处死大鼠并提取脊髓组织。行脊髓组织切片,进行免疫组化及免疫荧光检测,观察hNSCs的存活、分化情况;观察NF-H、GFAP的表达情况;HE染色观察局部空洞形成情况;脊髓组织匀浆后行Western blot检测,观察受损脊髓组织内NF-H,NGF蛋白表达情况。研究结果(1)BBB评分本实验结束时,各组大鼠后肢功能BBB评分由高到低排列分别为:hNSCs+ES组,ES组,hNSCs组,PBS组;各组间表达差异均具有显著统计学意义(p<0.01)。(2)免疫荧光hNSCs的存活及向神经元分化的检测所移植hNSCs的存活检测结果为:hNSCs+ES组存活数量大于hNSCs组,差异具有统计学意义(p<0.05)。所移植存活的细胞分化为神经元的数量,hNSCs+ES组大于hNSCs组,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)NF-H免疫荧光表达结果HNSCs组、ES组及hNSCs+ES组脊髓损伤部位瘢痕组织周围NF-H的表达较PBS组均增高,差异具有统计学意义(PBS组vs hNSCs组,P<0.05;PBS组vs ES组及hNSCs+ES组,P<0.01)。三个治疗组NF-H表达由高到低为hNSCs+ES组、ES组及hNSCs,三组两两之间表达差异亦具有统计学意义(hNSCs+ES组vs ES组,p<0.05;hNSCs+ES 组 vs hNSCs 组,p<0.01;ES 组 vs hNSCs 组,P<0.01)。(4)免疫组化检测GFAP在脊髓损伤部位胶质瘢痕中的表达脊髓损伤部位胶质瘢痕组织GFAP表达,三个治疗组与对照组(PBS组)相比,GFAP表达降低,差异具有统计学意义(PBS组vs hNSCs组及hNSCs+ES组,P<0.01;PBS组vs ES组,p<0.05)。其中,hNSCs+ES组表达最低,与其余三组相比差异具有统计学意义(hNSCs+ES组vs hNSCs组,p<0.05;hNSCs+ES组vs ES及 PBS 组,p<0.01)。(5)脊髓损伤部位坏死空洞区域HE染色HE染色检测脊髓损伤局部坏死空洞面积,hNSCs组及hNSCs+ES组小于PBS组,数据差异有统计学意义(hNSCs组vs PBS组,p<0.05;hNSCs+ES组vs PBS组,p<0.01)。ES组面积数值虽比PBS组小,但差异无统计学意义。(6)Western blot检测受损脊髓组织匀浆NF-H及NGF表达NF-H的检测结果,三个治疗组,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs组较对照组均明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。hNSCs+ES组较ES及hNSCs组表达增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。ES组较hNSCs组亦明显增高(P<0.01)。关于NGF的western blot检测,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs三个治疗组较PBS组均明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01);但三个治疗组间差异没有统计学意义。研究结论(1)HNSCs移植及电刺激均能促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,以二者联合应用效果最好。(2)电刺激能促进hNSCs的存活,并能提高其分化为神经元的数量。(3)HNSCs移植及电刺激在体内能通过促进受损脊髓组织中NGF分泌、NF-H的表达,下调损伤局部GFAP的表达,抑制受损脊髓局部胶质瘢痕形成等机制,促进受损脊髓的修复。