交换形成相关基因的RNAi载体构建及转化甘蓝型油菜研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:viclee0716
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减数分裂中,同源染色体相互识别、配对后在非姊妹染色单体间发生片段交换,导致同源重组的发生。同源重组是生物多样性产生的重要来源之一。近年来,随着研究者对模式植物拟南芥、水稻减数分裂机制的深入研究,越来越多的参与交换形成的基因被发掘,使得人工调控交换的发生及其频率成为可能,在作物遗传育种中具有重要的潜在应用价值。甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC)为白菜(B.rapa,AA)与甘蓝(B.oleracea,CC)杂交形成的异源四倍体,是我国重要的油料作物之一。由于缺少天然及人工突变体,对其减数分裂调控机制的研究鲜有报道。本研究的主要目的是利用RNAi技术降低甘蓝型油菜中相关基因(均为拟南芥减数分裂中参与交换形成的同源基因)的表达,分析甘蓝型油菜减数分裂中交换形成的分子机制,并为通过同源/部分同源重组引入野生近缘种优异基因建立材料基础。主要结果如下:1)利用RT-PCR扩增,从甘蓝型油菜Westar中获得FIGL1、MHF1、XRCC2、ASY1和MUS81目标干涉区段。以质粒pFGC-5941为骨架,构建了上述五个基因的RNAi载体,并通过酶切与测序验证。2)利用农杆菌介导的遗传转化技术,以下胚轴为外植体,将上述载体分别转入甘蓝型油菜Westar、J9709和JW76中,抗性筛选后共得到再生植株78株。3)对其中66株进行PCR检测,共鉴定到阳性植株48株,平均转化效率为72.73%。其中带有FIGL1载体阳性植株25株,MHF1阳性株8株,XRCC2阳性株15株。另外,获得MUS81转化再生苗12株,尚未鉴定;未获得ASY1转化植株。4)根据各基因保守序列设计引物,通过qRT-PCR技术分析转基因阳性植株花蕾中目标基因的表达情况。结果表明,在14株阳性植株中目标基因表达量不同程度低于野生型材料。5)与野生型相比,各阳性植株花粉母细胞减数分裂未发现明显异常。这与拟南芥中上述基因的突变体表型相一致,这些突变体均具有正常减数分裂进程,但同源染色体交换频率增加。
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