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G蛋白偶联受体(GPCRs)家族是一类具有七个跨膜蛋白结构域的跨膜蛋白受体,是将细胞表面接收的信号转换成细胞内的信号的一类受体蛋白;它们广泛地参与细胞增殖、分化、迁移等各类生理过程的调控,其调控出现异常时能够导致肿瘤等疾病的发生。在本论文中,我们研究了 3个GPCR蛋白(GPR48、GPR54和GPR124)分别在乳腺成体干细胞形成、乳腺发育、乳腺癌和肿瘤血管发生中的作用及其调控机制。1.G蛋白偶联受体48(Gpr48)通过Sox2调控小鼠乳腺发育和乳腺干细胞的功能;Gpr48单倍剂量不足(Gpr48+/-)延迟了乳腺癌的发生发展和肺转移。GPR48，又称为富含亮氨酸重复G蛋白偶联受体-4(LGR4),属于在胞外N末端富含亮氨酸重复序列的GPCRs家族的一员。已有报道发现LGR家族中的其它成员在很多组织中能够作为成体干细胞标记存在,且调节干细胞的自我更新和分化能力。在这里我们利用敲除小鼠模型研究G蛋白偶联受体Gpr48对小鼠乳腺成体干细胞、乳腺发育和乳腺癌发生与转移的生物学功能及其调控机制。我们发现敲除Gpr48引起乳腺干细胞数目减少和自我更新能力减弱,乳腺球的形成能力从第三代开始急剧减弱。限制性稀释移植实验表明在敲除Gpr48的小鼠乳腺中的干细胞数目明显减少。这些结果说明Gpr48在乳腺干细胞自我更新的能力上起着非常重要的调节作用。乳腺导管分支形成实验(mammary organoid culture)表明敲除Gpr48导致导管树形分支减少。进一步的信号调控机制分析发现在敲除Gpr48的小鼠乳腺球中Wnt信号途径的很多靶基因的mRNA水平明显下降,特别是其中我们已知的参与细胞重建的核心调控因子Sox2的mRNA水平下降尤为明显。在Gpr48敲除小鼠乳腺中过表达Sox2能够修复Gpr48缺失导致的乳腺自我更新能力的缺陷,说明Gpr48主要是通过Sox2对乳腺干细胞自我更新能力进行调控。同时,我们通过启动子分析和CHIP实验确认Gpr48通过调控Sox2的启动子的一个LEF1结合位点和CRE结合位点的结合能力而调控Sox2的表达。而加入Wnt3a能够修复Gpr48缺失导致的乳腺导管形成能力减弱的缺陷。基于这些结果,我们构建出Gpr48的作用模型:Gpr48 同时通过 Wnt/β-catenin/Lefl 和 cAMP-PKA-CRE 信号途径调控Sox2的表达来调控乳腺干细胞的自我更新和乳腺发育。我们利用MMTV-PyMT小鼠分析了 Gpr48对乳腺癌发生和转移的调控作用。对Gpr48敲除和MMTV-PyMT鼠杂交子代的乳腺癌组织(6周、9周、13周和15周)进行H&E分析发现,Gpr48缺失和杂合子鼠(基因型为PyMT&Gpr48+/-和PyMT&Gpr48-/-)均导致不同程度的乳腺癌发生发展延迟的表型。通过PCNA免疫组织化学分析发现Gpr48的缺失抑制了肿瘤细胞增殖;而通过肿瘤生存曲线分析发现Gpr48的单倍剂量不足导致乳腺癌的发病延迟；通过对肿瘤形成数目的统计分析发现Gpr48的单倍剂量不足减少了肿瘤的形成数目。同时,通过组织切片和PyMT免疫组织化学染色发现,Gpr48的单倍剂量不足推迟且抑制了乳腺癌相关的肺转移。在体外分析中,我们通过在MDA-MB-231细胞中干扰GPR48的表达抑制乳腺癌细胞的增殖作用后,进行细胞迁移和细胞侵入实验,发现在没有细胞增殖的影响下,细胞迁移和细胞侵入都受到GPR48的调控。总之,Gpr48通过cAMP-PKA-CRE和Wnt信号途径调控Sox2等靶基因的表达,从而调节乳腺干细胞的活性和乳腺的生长发育;同时,Gpr48也能调控乳腺癌的发生、发展和肺转移。2.G蛋白偶联受体54(GPR54)单倍剂量不足延迟了乳腺肿瘤的起始、发生发展和肺转移。已知配体kisspeptins能够激活KISS1受体(KISS1R或GPR54)从而调控其在正常的生理状况和病理性生理状态下的功能。在癌症状态下,GPR54能够调控肿瘤血管新生和转移,但GPR54在肿瘤发生发展过程中的作用还是一个未知数。在该研究中,我们利用Gpr54基因敲除小鼠模型和MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型交配得到的小鼠模型进行研究发现,Gpr54杂合子的MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤的起始、发展、延迟、多样性和肺转移都有不同程度的减弱和降低。为了确认这些并评估可能的内源性配体的作用,我们分离了PyMT/Gpr54+/+和PyMT/Gpr54+/-小鼠的原发肿瘤细胞,通过体内和体外表型对比分析发现,Gpr54的缺失降低了体外的致瘤性,以及体内免疫功能低下的NOD.SCID/NCR鼠的肿瘤形成。通过Kisspeptin-10 能够激活的 Gpr54,Gpr54 接着通过 Gαq-p63RhoGEF信号激活RhoA,以及依赖于RhoA活化的一系列基因的表达。此外,锚定非依赖性生长(Anchorage-independent growth)是与Gpr54剂量依赖性RhoA调控紧密相连的。为了支持这些结果,我们在人类MCF10A乳腺上皮细胞中通过siRNA技术敲除Gpr54的表达或过表达H-RasV12使RhoA失活,都能降低Ras诱导的锚定非依赖性生长。总之,Gpr54单倍剂量不足通过抑制其下游Gαq-p63RhoGEF-RhoA信号途径导致乳腺肿瘤的发生、发展和转移的延迟。3.G蛋白偶联受体124(GPR124)在内皮细胞中对VEGF诱导的肿瘤血管发生中的作用。GPR124又叫做肿瘤内皮细胞标记5(tumor endothelial marker,TEM5),在肿瘤血管中高度表达。虽然最近有GPR124对血管发生(vasculogenesis)的作用的报道,但其在肿瘤血管发生中的作用仍不清楚。我们的研究发现,GPR124对于VEGF诱导的肿瘤血管发生是必须的。表达分析表明,GPR124在肿瘤原位血管中(胃癌、肺癌、乳腺癌、肠癌)和培养的血管内皮细胞(如HUVEC、HMEC)中高度表达。通过移植小鼠肿瘤生长模型分析表明,GPR124在内皮细胞中的沉默能够抑制肿瘤血管生成和肿瘤的生长。体外研究表明,GPR124调控VEGF诱导的肿瘤血管发生的一些重要的细胞学过程,如细胞和细胞的相互作用、渗透性、迁移、侵入和管腔形成,但对细胞的增殖几乎没有影响。而且,VEGF调控GPR124的表达且能够剪切该基因的细胞外区域。含RGD位点的GPR124的N-末端能够抑制细胞迁移和管腔结构的形成(tube formation)。GPR124的N-末端上的GST-RGD蛋白片段能够诱导内皮细胞的粘性和阻止αVβ3-或α5β1-介导的细胞相互作用,说明GPR124的N-末端片段可以作为integrin的配体存在。总之,我们的研究结果表明,GPR124对于VEGF诱导的肿瘤血管新生起着促进作用。