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[研究背景]白血病是世界上最常见的肿瘤之一,其发生率死亡率均位居癌症首列。白血病的发生和多种因素有关,例如物理因素,环境因素,遗传因素等等,但目前临床最为常见的是一种或多种细胞的基因突变导致的细胞功能异常,最终导致白血病发生。目前常见的白血病的致癌突变基因有BCR-ABL融合突变,FLT3-ITD融合突变,Notch1突变,JAK2（V617F）突变,IDH1/2突变,DNMTA突变,Ptpn11突变等等。而本课题组着重于Ptpn11功能激活型突变导致的白血病的发生。骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative neoplasma,MPN）是一类造血干细胞克隆性疾病,是一组起源于一系或多系细胞持续异常增殖为特征的疾病,常见的MPN包括慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症（polycythel1lia vera,PV）、原发性血小板增多症（essential thmmbocvthemia,ET）、原发性骨髓纤维化以及一些慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症及其他未分类疾病（骨髓增殖特性的一些骨髓恶性肿瘤,如慢性骨髓系白血病和非典型慢性髓细胞性白血病）[1,2]。患者临床表现为髓外造血（可导致脾肿大）、贫血、白细胞异常增多、骨髓纤维变性等症状,有些可转化为急性白血病。目前针对MPN尚无特异有效的治疗手段,主要为支持疗法,目的是降低过高的白细胞或脾大,但并不能延长患者寿命,也不能有效改善其全身症状。骨髓造血微环境是一种复杂的,可以支持造血生长,调节造血干细胞增殖分化的细胞微环境,又称为造血干细胞龛（HSC niche）,其主要包含支持细胞和支持分子,支持细胞主要有间充质干细胞,内皮细胞,巨核细胞,成骨细胞,血管窦等,而这些支持细胞分泌的支持分子如CXCL12和c-Kit等也可以灵活调节HSC的增殖和分化。有趣的是,除了在HSC中的基因突变会导致白血病外,近年来的研究发现在骨髓微环境细胞,尤其是间充质干细胞的基因突变也会导致白血病的发生,小鼠骨髓间充质干细胞的多种基因突变,例如Notch1,RORγ等突变同样会产生白血病表型[3-7]。临床研究中也常常发现在急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia,AML）和骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative Neoplasms,MPN）病人中有很大概率检测出间充质干细胞的基因突变,这与病人的不良预后成正相关[8]。Ptpn11是第一个被发现的非受体酪氨酸磷酸酶激酶,其编码的SHP2蛋白由N-SH2,C-SH2和PTP三个结构域组成。通过N-SH2结构域和PTP结构域的解耦联可以激活下游的磷酸化信号。病理学中,50%以上的努南综合征（Noonan Syndrome,NS）病人中发现有SHP2的激活突变[9,10],这些突变被认为是白血病尤其是青少年粒单细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia,JMML）,儿童骨髓增殖性肿瘤（juvenile myeloproliferative neoplasm,MPN）的高危因素,同时,因其在不同类型白血病中均存在着SHP2的异常活化和突变而被认为是白血病的原癌基因[11,12],近年认为它还与神经母细胞瘤及多种实体肿瘤有关[12-15]。本课题组早期发现,除了在造血干细胞的Ptpn11突变会导致MPN的发生外,在骨髓的间充质干细胞中Ptpn11激活突变同样会导致MPN的发生。该研究发现其可发生与造血细胞Ptpn11激活突变同样的白血病表型,且发现这一过程是由于突变的MSCs募集单核细胞,单核细胞分泌促炎症因子使得的HSC离巢分化导致MPN的产生[16]。然而,该研究将核心针对向骨髓微环境的一个复合作用,未对MSCs的Ptpn11突变产生的功能改变进行深入的探讨,因此,本课题组将针对Ptpn11突变对MSCs的改变,尤其是代谢中的改变进行深入探讨,运用分子生物学,组织形态学,细胞生物学等方法研究Ptpn11激活突变对骨髓微环境的代谢调控作用并探讨其致骨髓增殖性肿瘤和白血病的分子机制,为血液系统肿瘤的临床治疗提供新的线索。[研究方法]1.配繁基因型为Ptpn11E76K/+;Mx1-Cre的Ptpn11 E76K激活突变小鼠以及Ptpn11+/+;Mx1-cre的对照组小鼠,并通过PIPC诱导Cre酶的表达,诱导Ptpn11E76K在Mx1阳性的骨髓造血干细胞和间充质干细胞中突变。2.将小鼠CO2窒息致死后分离出股骨和胫骨,通过骨髓穿刺冲洗出骨髓细胞,并采用浓度为0.25%的I型胶原酶消化骨组织,通过贴壁培养获得骨髓中的间充质干细胞,用含有10%FBS的DMEM培养。3.将冲洗出的骨髓细胞进行蛋白组学和代谢组学验证。4.对骨头进行冰冻和石蜡切片,通过油红O染色和Masson染色检测骨髓的脂质差异和胶原纤维差异。5.在贴壁细胞培养2-5代后进行细胞实验。采用MTT检测细胞的增殖能力,采用RT-qPCR检测造血支持的趋化因子CXCL12和SCF的表达,采用流式检测细胞的葡萄糖摄取能力和细胞的ROS水平。6.采用Seahorse分析Ptpn11突变组相对于对照组的细胞氧气消耗速率（Oxygen Consumption Rate,OCR）和细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate,ECAR）的改变。7.检测细胞的ATP水平和乳酸水平变化,然后通过RT-qPCR和流式细胞术检测细胞线粒体数量的变化。8.通过Western Blotting检测代谢相关信号通路的变化。9.检测细胞线粒体数量和膜电位变化。10.检测细胞线粒体复合物差异。[实验研究结果]1.待PIPC注射两个月后检测实验组小鼠即表现为明显的骨髓增生性肿瘤（MPN）表型。其脾脏肿大,骨髓原始粒细胞明显增多,红细胞减少。小鼠骨髓细胞Ptpn11 E76K突变的诱导表达达到了97%。2.从骨髓和骨头上分离的间充质干细胞形态良好,活性较强。3.骨髓的油红O染色显示Ptpn11激活突变小鼠的骨髓脂质明显减少,Masson染色显示Ptpn11激活突变组小鼠骨头胶原纤维减少。4.Ptpn11 E76K突变的MSCs增殖能力增强,CXCL12和SCF的m RNA表达水平降低,葡萄糖摄取能力提高,氧化磷酸化副产物ROS增高。5.在有氧氧化中,Ptpn11激活突变小鼠间充质干细胞的基础和最大氧气消耗速率增强,无氧糖酵解中最大细胞外酸化率增强,而基础细胞外酸化率无明显差异。6.Ptpn11激活突变小鼠间充质干细胞的胞内ATP水平升高,而乳酸水平无明显差异,与Seahorse的结果相一致。7.Ptpn11激活突变未对MSCs的线粒体数目产生影响,并且细胞的磷酸化AMPK表达降低,m TOR及其蛋白质磷酸化水平升高。8.Ptpn11E76K/+MSCs的线粒体数量没有明显改变,而细胞的膜电位水平增强了。9.Ptpn11E76K/+MSCs的线粒体电子传递链复合物的活性发生了改变。[结论]Ptpn11激活突变增加了间充质干细胞的有氧氧化水平,这种改变不是通过增加线粒体数目导致的,有可能是通过增加线粒体功能产生的。