论文部分内容阅读
膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤,卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)腔内灌注是防治膀胱肿瘤的重要辅助手段,近年来小剂量BCG和干扰素联合灌注的方法在治疗膀胱浅表肿瘤、预防肿瘤复发方面显示出较好的耐受性,但其所致的膀胱局部与全身并发症使得BCG膀胱腔内灌注的应用受到一定的限制,本实验室成功研制的重组人IFN-a-2b-BCG(Interferon-a-2b-BCG)是一种新型菌苗,与野生BCG比较,除了保留野生BCG的基本特性外,优势在于可以持续分泌IFN-a-2b, BCG和IFN-α-2b二者同时作用可以产生最佳的免疫诱导效应,抗肿瘤作用更明显,副作用发生较少,更适合病人长期灌注。研究目的：在前期研究中,已经成功构建了一种能够分泌hIFN-a-2B的重组卡介苗,为进一步推动重组人IFN-a-2b-BCG的后续研究,以至于最终应用于临床实践,我们本次进行了以下两方面的工作：第一部分主要进行重组人IFN-a-2b-BCG对T24细胞系的肿瘤杀伤和抑制情况研究,阐明重组BCG对膀胱肿瘤细胞的杀伤效果及直接细胞毒性作用。第二部分由于BCG对多种抗生素耐药,且灌注后常引起尿急、尿痛、败血症等不良反应,检测重组人IFN-a-2b-BCG对十种常见抗菌药物的敏感性,探索重组人IFN-a-2b-BCG免疫途径的安全性和有效性。实验方法：第一部分：(1)重组IFN-a-2b-BCG活化淋巴细胞生成rBAK细胞(Recombinant Bacillus Calmette-Guerin activated killer cell,rBCG激活杀伤细胞),与人膀胱癌T24细胞共同培养,采用MTT(噻唑蓝)法测rBAK细胞对肿瘤细胞的抑制率；(2)将重组IFN-a-2b-BCG和人膀胱癌T24细胞体外共同培养,采用MTT、电镜、荧光染色等方法了解其直接体外抗肿瘤的效果和作用机制。第二部分：了解重组人干扰素α-2b-卡介苗(hIFN-a-2b-BCG)的药物敏感情况,采用人工划线培养基及BACTEC960系统检测方法,检测重组人干扰素α-2b-卡介苗和野生BCG对十种常见药物的敏感性,探讨重组BCG灌注的安全有效性,及正确有效地使用抗菌药物治疗膀胱癌灌注后引起的不良反应,同时降低抗菌药物对重组BCG菌株抗肿瘤作用的影响。研究结果：第一部分：(1)在三个不同时段,单纯未经诱导的淋巴细胞活性较低,对肿瘤细胞T24的抑制率最低,经野生BCG激活后的淋巴细胞开始增殖、分泌相关细胞因子、免疫活性增强,对肿瘤细胞的抑制明显增强(26.39%-48.95)；持续分泌IFN-α-2b的重组BCG持续激活淋巴细胞后对肿瘤细胞的抑制率最高(37.63～63.10),与野生型相比有统计学差异。(2)重组BCG与膀胱肿瘤(T24)共同培养,光镜下可见肿瘤细胞变圆,增殖速度明显减缓,部分细胞脱壁,胞浆可见大量空泡和颗粒状物质,细胞周围有菌群包绕；透射电镜下可见肿瘤细胞表面微绒毛脱落,染色质溶解,细胞质坏死,出现大量空泡,细胞表面有出泡现象；吖啶橙染色可见肿瘤细胞聚集成团状细胞球体,胞突消失,细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体出现；MTT法测定重组BCG对膀胱肿瘤细胞(T24)的抑制效应,结果表明重组BCG抑制T24细胞生长,且抑制率均高于野生型。第二部分：重组BCG和野生BCG对十种药物的敏感性结果：单次注射或口服某种药物后,假设当重组BCG和野生BCG对某种药物敏感的浓度低于该药物在血液中浓度的25%时,两种BCG菌株系统敏感；当两种BCG菌株对某种药物敏感的浓度低于尿液中药物浓度的25%时,为局部敏感。在系统耐药检测结果中,重组人干扰素hIFN-a-2b-BCG对抗结核类药物中除吡嗪酰胺耐药外,对利福平、异烟肼、乙胺丁醇均敏感,与野生BCG相同；对氨基糖苷类药物中的庆大霉素和卡那霉素耐药,对丁胺卡那、链霉素敏感,而野生BCG只对庆大霉素耐药,对其他三种氨基糖苷类药物敏感；对喹诺酮类中的氧氟沙星、环丙沙星均敏感,与野生BCG相同。因许多药物有很高的尿液回收率,所以药物在膀胱中的浓度远高于在血液中的浓度。在局部耐药检测结果中,重组人干扰素hIFN-a-2b-BCG和野生BCG除对抗结核类药物中毗嗪酰胺耐药外,对其它九种药物均敏感。结论：我们认为,重组IFN-a-2b-BCG具有诱导淋巴细胞杀伤膀胱肿瘤T24细胞的能力,其自身可抑制膀胱肿瘤的生长,诱导凋亡,且抑制率高于野生型BCG；重组人干扰素α-2b-卡介苗对喹诺酮类的氧氟沙星、环丙沙星敏感,对氨基糖苷类药物的庆大霉素和卡那霉素耐药；在抗结核类药物中,除对毗嗪酰胺耐药外,对利福平等其他几种抗生素均敏感。因此本研究结果提示使用合理的药物提高膀胱内BCG灌注免疫治疗的安全性和有效性。