【摘 要】
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目的:制作PLGA-OVA-R848纳米疫苗,对其形貌特征进行表征及其内包裹的过敏原蛋白成分进行鉴定,并探讨其在鸡卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠舌下免疫治疗（Sublingual immunotherapy,SLIT）的机制,为过敏性哮喘的过敏原免疫疗法（Allergen immunotherapy,AIT）治疗策略提供新的方案。方法:采用复乳溶剂挥发法制备PLGA-O
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目的:制作PLGA-OVA-R848纳米疫苗,对其形貌特征进行表征及其内包裹的过敏原蛋白成分进行鉴定,并探讨其在鸡卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠舌下免疫治疗（Sublingual immunotherapy,SLIT）的机制,为过敏性哮喘的过敏原免疫疗法（Allergen immunotherapy,AIT）治疗策略提供新的方案。方法:采用复乳溶剂挥发法制备PLGA-OVA-R848纳米疫苗,观察其形貌特征及粒径大小;采用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测纳米颗粒中OVA蛋白的完整性、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测纳米颗粒中蛋白的抗原性、非干扰型蛋白浓度测定法检测体外纳米颗粒中过敏原蛋白的累积释放率、反转录实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测纳米颗粒对小鼠巨噬细胞（RAW264.7）活性的影响。4-5周龄BALB/c雌性小鼠40只随机分为空白对照组（n=5）和OVA致敏组（n=35）,对致敏组小鼠采用OVA混合佐剂AL（OH）3皮下注射致敏及OVA滴鼻激发建立过敏性哮喘小鼠模型,正常组给予磷酸盐缓冲液（PBS）代替;ELISA检测致敏组小鼠血清表达OVA特异性免疫球蛋白E（sIgE）验证过敏性哮喘模型成功建立后,致敏组小鼠再随机分为7组分别给予相应药物进行为期2周的SLIT,每周给药2次。末次治疗结束后,除正常组小鼠给予PBS滴鼻激发外,其余各组小鼠均给予20 ug OVA滴鼻激发,每天1次,连续3天。激发后24 h处理小鼠。ELISA法检测各组小鼠血清OVA特异性Ig E、免疫球蛋白G1（Ig G1）、免疫球蛋白G2a（Ig G2a）的抗体水平及小鼠肺泡灌洗液上清、脾细胞培养上清中白细胞介素4、5、13（IL-4、IL-5、IL-13）及白细胞介素10（IL-10）、干扰素γ（IFN-γ）等细胞因子水平;苏木素-伊红染色（H＆E）和过碘酸-希夫（PAS）染色观察小鼠肺组织炎症浸润情况;CCK-8法检测小鼠脾淋巴细胞增殖抑制情况;流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中OVA特异性调节性T细胞（Tregs）比例。结果:1、PLGA-OVA-R848纳米颗粒呈表面光滑的圆球形,外观形态良好、无破损、裂口,纳米颗粒分散性好、无粘连,粒径大小为（219.20±18.56）nm,包封率为（68.25±2.05）%,载药量为（6.75±0.2）%。纳米颗粒中的OVA蛋白分别于SDS-PAGE及WB中呈现出清晰的条带,并于37℃,100 rpm/min,PH 7.40的条件历经132 h后显示出最大累积释放率为45.65%。2、PLGA-OVA-R848纳米颗粒可诱导RAW264.7产生白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β）的m RNA表达增加。3、SLIT后,PLGA-OVA-R848纳米疫苗可有效降低OVA过敏性哮喘小鼠血清中sIgE、sIgG1水平,并显著提高血清中sIgG2a水平。4、PLGA-OVA-R848纳米疫苗可有效降低过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液及脾细胞培养上清中IL-4、IL-5、IL-13细胞因子的含量,同时提高脾细胞上清中IL-10细胞因子含量。5、PLGA-OVA-R848纳米疫苗有效改善过敏性哮喘小鼠肺组织气道粘液高分泌现象及气道周围炎性细胞浸润。6、PLGA-OVA-R848纳米疫苗能有效抑制脾脏中OVA特异性淋巴细胞增殖。7、PLGA-OVA-R848纳米疫苗可有效促进小鼠脾淋巴细胞中OVA特异性Tregs比例升高。结论:1、本实验成功制备了纳米级别的过敏原疫苗,其内包裹的过敏原蛋白可保持良好的完整性及抗原性;纳米疫苗在37℃、PH 7.40的条件下仍具备长效缓释特性,并可有效刺激抗原提呈细胞（APC）分泌免疫调节因子,为过敏性哮喘小鼠的免疫治疗提供了良好的基础;2、PLGA-OVA-R848纳米疫苗通过诱导sIgG2a抗体生成阻止sIgE促进的过敏原呈递及特异性结合过敏原抑制过敏性炎症,并有效降低sIgG1含量;3、PLGA-OVA-R848纳米疫苗可有效逆转OVA过敏性哮喘小鼠的2型T辅助细胞（Th2）极化,有效恢复Th2和1型T辅助细胞（Th1）之间的平衡,改善过敏性哮喘小鼠的过敏性炎症;4、PLGA-OVA-R848纳米疫苗抑制体内过敏原特异性淋巴细胞的过度增殖,有效抑制过度、过强的免疫反应;5、PLGA-OVA-R848纳米疫苗促进过敏原特异性Tregs的增殖,有效调节不利的免疫反应。
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