论文部分内容阅读
本研究利用分子生物学、病毒学等技术和手段,为解决目前口蹄疫防控技术方面的不足,筛选了高效抗口蹄疫病毒相关基因三种:猪机体内广谱抗病毒基因—γ干扰素(IFN-γ);抗口蹄疫病毒单链抗体基因(scFv);猪IFN-γ及抗口蹄疫病毒scFv融合基因,获得了相应的携带抗口蹄疫病毒相关基因的重组反转录病毒载体,建立了相应的抗口蹄疫病毒转基因细胞系,同时为抗口蹄疫病毒转基因动物的研究打下基础。首先,通过反转录病毒系统构建了分别含有猪体内IFN-γ、单链抗体基因scFv和IFN-γ与scFv融合基因,以及对照基因EGFP的重组反转录病毒载体pFB-IFN、pFB-scFv、pFB-Is和pFB-EGFP。然后将重组反转录病毒载体和两个辅助病毒包转载体共转染HEK 293T包装细胞后,收获含有抗口蹄疫病毒基因和对照基因的重组病毒MMLV-IFN、MMLV-scFv、MMLV-Is和MMLV-EGFP。用重组病毒感染供体猪成纤维细胞,这些抗口蹄疫病毒基因和对照基因就随着病毒感染细胞后反转录形成的cDNA整合到细胞染色体基因组中,建立了抗口蹄疫转基因猪成纤维细胞系WMP-IFN、WMP-scFv、WMP-Is和对照基因EGFP的转基因猪成纤维细胞系WMP-EGFP。通过一系列实验研究证明,所获得转基因细胞系性状稳定,形态完整、增殖性能未受影响。本研究采用PCR方法验证抗口蹄疫病毒相关基因在所获得转基因细胞中的整合情况,将A型口蹄疫病毒感染所获得转基因细胞后,通过MTT法比较口蹄疫病毒对阳性细胞和正常细胞的杀伤率,验证细胞的抗口蹄疫功能。结果显,WMP -IFN、WMP- scFv和WMP-Is均能不同程度的抵抗口蹄疫病毒。上述研究为有效结合体细胞克隆技术,培育出抗口蹄疫转基因猪奠定了基础。