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目的:胆结石又称胆石症,是发生在胆道系统内的一种病理矿化现象,其发病率约占世界人口的7%～10%,且呈明显增高的趋势。随着大量新技术、新方法的应用,越来越多的研究发现,胆道感染与胆囊结石形成密切相关,并在大多数胆石病患者的胆囊内发现存有细菌感染,因此,细菌感染与胆囊结石之间的关系受到越来越多的关注。纳米细菌(Nanobacteria, Nb)是一种体积微小、生长缓慢具有独特的生物矿化作用的微生物,有研究表明纳米细菌的感染可能与胆结石的发病有关。本研究主要是通过对胆汁培养的纳米细菌感染日本大耳白兔致胆结石形成,探讨纳米细菌感染与胆石症发生的相关性。方法:1胆汁纳米细菌分离、培养及鉴定1.1选择无急性胆囊炎发作病史,腹腔镜手术前未接受抗生素治疗的6位胆囊结石患者,无菌操作抽取胆汁,经0.22μm滤膜过滤除菌后置DMEM全培养液中进行纳米细菌培养,同时做DMEM全培养液培养、合成羟基磷灰石(Hap)培养及经180℃干烤4小时灭活的纳米细菌培养分别作为对照组。1.2用扫描电镜对纳米细菌培养物及羟基磷灰石进行能谱分析。1.3用透射电镜对纳米细菌培养物及羟基磷灰石进行形态学观察。1.4用间接免疫荧光染色对纳米细菌培养物进行特异性鉴定并用Von KOSSA染色检测纳米细菌培养物表面的矿化物。1.5用Bisbenzimide H 33258染色剂对纳米细菌培养物进行DNA染色。2胆汁纳米细菌的感染性实验2.1采集所有实验性日本大耳白兔耳静脉血5ml,分离血清并用ELISA检测,排除纳米细菌抗体阳性实验家兔。2.2动物感染性实验2.2.1实验分组2.2.1.1胆石症患者胆汁纳米细菌培养物感染性实验实验家兔48只随机分成3组:患者胆汁Nb培养物感染组16只;DMEM全培养液空白对照组16只;Hap对照组16只。2.2.1.2家兔胆汁纳米细菌传代培养物感染性实验实验家兔48只随机分成3组:家兔胆汁Nb培养物感染组16只; DMEM全培养液空白对照组16只;灭活的Nb培养物对照组16只。2.2.2动物感染2.2.2.1将动物麻醉后,于右肋缘下开腹,肝下寻找胆囊,抽出胆囊胆汁,注入实验用悬液,生物胶封闭胆囊壁穿刺孔,关腹,肌肉注射青霉素3天(40万单位/次/日),单笼饲养3周。2.2.2.2耳缘静脉采血5ml后麻醉处死实验家兔。抽取胆汁后剖开胆囊观察成石情况并收集胆结石。切取肝脏和胆囊组织块,用10%甲醛和2.5%戊二醛分别固定。2.2.2.3将实验干预前和处死前所收集的家兔胆汁样本再次传代培养。3实验家兔标本的检测3.1用HE染色法和透射电镜对感染家兔胆囊和肝脏组织标本进行病理学观察。3.2用Von KOSSA钙染色法和间接免疫荧光染色法对实验家兔胆囊和肝脏组织标本进行纳米细菌检测。3.3对处死前所采血液分离的血清进行ELISA检测。4统计学方法采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析,P<0.05时,结果有统计学意义。结果:1.6份胆结石患者胆汁样本、患者胆汁Nb培养物感染组及家兔胆汁Nb培养物感染组家兔胆汁样本纳米细菌培养均为阳性。所有对照组家兔胆汁及实验干预前所抽取的家兔胆汁样本纳米细菌培养均为阴性。2.在37℃和5%CO2培养条件下,纳米细菌在含有10%γ-FBS的DMEM培养液中缓慢生长。培养2周时,在倒置相差显微镜下可见做布朗运动的微小的颗粒状纳米细菌。3周时,可见纳米细菌开始粘附于培养瓶底部形成细菌被膜(Biofilm),此时在培养瓶的底部可见附着少量的白色颗粒状沉淀;4周时白色颗粒状沉淀明显增多,众多纳米细菌聚集成细菌集落;培养过程中,培养基的pH值无明显变化。传代后的纳米细菌仍维持上述生物学特性。3.透射电镜下观察,纳米细菌约为80～350nm,呈椭球形或短棒状,其表面被覆细菌被膜;扫描电镜能谱分析(EDX)显示,纳米细菌外壳含有钙、磷、镁、铝、氧、铬、铜、铁等元素,其钙/磷比值为1.62,与羟基磷灰石中钙/磷比值相似。4.经硝酸银染色(Von KOSSA法)纳米细菌形成的矿化外壳呈黑色。5.间接免疫荧光染色显示纳米细菌被荧光标记抗体结合,荧光显微镜下呈绿色荧光。6.纳米细菌可被Bisbenzimide H 33258染色剂染色,发出特征性的蓝色荧光,说明纳米细菌含有DNA成分。7.胆石症患者胆汁纳米细菌培养物感染性实验中患者胆汁纳米细菌培养物感染组胆结石发生率(81.25%)与DMEM对照组(6.25%)和羟基磷灰石对照组(18.75%)比较,P<0.05,差异有统计学意义。家兔胆汁纳米细菌传代培养物感染性实验中家兔胆汁Nb培养物感染组胆结石发生率(56.25%)与DMEM对照组(6.25%)和灭活纳米细菌培养物对照组(12.5%)比较,P<0.05,差异有统计学意义。8.胆囊HE染色显示,纳米细菌培养物感染组大部分(22/32)家兔胆囊有炎症浸润;肝组织变化轻微。通过透射电镜对胆囊及肝脏超薄切片进行观察,纳米细菌感染组胆囊及肝脏超微结构发生改变,对照组超微结构基本正常。9.Von KOSSA染色显示,纳米细菌培养物感染组家兔胆囊壁粘膜上皮层及平滑肌层均可见微小的黑色颗粒散在分布而Hap对照组、DMEM对照组和灭活的Nb对照组均未发现黑色颗粒;间接免疫荧光染色显示,纳米细菌培养物感染组中,纳米细菌分布于胆囊粘膜上皮层及平滑肌层中,对照组均未见纳米细菌。10.ELISA检测结果:胆石症患者胆汁纳米细菌培养物感染性实验中患者胆汁Nb培养物感染组阳性率为100%,两个对照组阳性率为0。家兔胆汁纳米细菌传代培养物感染性实验中家兔胆汁Nb培养物感染组阳性率为100%;DMEM全培养液培养空白对照阳性率为6.25%;灭活的Nb培养物对照组阳性率为25%。结论:1.胆囊结石患者胆汁中可分离出纳米细菌,并能在体外传代培养。2.纳米细菌体积微小,生长缓慢,能在生理条件下于其菌体表面产生羟基磷灰石矿化外壳。3.纳米细菌体外培养物感染家兔可致家兔胆囊结石形成。4.从胆囊结石形成家兔胆汁中可分离出纳米细菌,经传代、再感染家兔,使其形成胆囊结石。5.纳米细菌感染家兔后,可使家兔血清中产生抗纳米细菌的特异性抗体。6.纳米细菌感染家兔后,能使胆囊及肝脏组织在3周内出现增生、萎缩、炎性浸润等病理变化。7.从人胆汁和感染家兔所分离的纳米细菌生物学特性具有一致性且均可致胆囊、肝脏组织发生病变。