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重症肌无力是一种典型的抗体介导的,辅助性T细胞依赖的自身免疫性疾病。小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性的长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA,能够在转录后水平调节mRNA表达。miRNA介导的基因调控对正常细胞的生命过程,如细胞的周期,分化,增殖,凋亡和免疫功能都是至关重要的。已报道miRNA在许多自身免疫性疾病中存在重要的作用。
本课题首先利用miRNAs芯片技术发现重症肌无力病人中存在差异表达miRNAs,且经过中药复方健肌宁干预治疗后部分差异miRNAs表达水平有所恢复。同时利用生物信息学对差异miRNAs的靶基因进行GO分析和Pathway分析,发现差异miRNAs可能的显著功能和参与的信号通路。进一步选择其中差异最显著的一个miRNAs家族let-7,使用Real-timePCR对大量样本中的let-7家族四个成员的表达水平进行检测,结果也验证了芯片结果的正确性,并选择let-7家族成员中最具代表性的let-7c作为进一步研究对象。为了探索let-7c在自身免疫性疾病中的发病机制,我们将重点放在其对IL-10的调控作用上。miRNAs的转录后调控基因表达是通过结合至靶基因mRNA的3UTR上。两者结合后可导致靶mRNA的降解从而减少靶基因编码蛋白的翻译。因此,首先通过靶点预测软件确定了let-7c和IL-103UTR可能存在的结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实let-7c可通过结合至IL-10的3UTR而调控蛋白的表达。进一步,Real-timePCR实验显示重症肌无力病人中的let-7c水平和IL-10mRNA水平呈负相关性。又通过PMA和PHA刺激Jurkat细胞后发现内源性let-7c的表达水平的改变和IL-10的表达水平的改变趋势相反。最后,通过转染外源的let-7cmimics和Inhibitor后,也证实了let-7c对IL-10表达的负性调控作用。已知IL-10刺激B细胞产生抗体的功能是一些抗体介导的自身免疫性疾病的基础,故以上研究表明let-7c可能可通过调控IL-10的表达而在重症肌无力的发病机制存在重要影响。
综上,我们的研究发现miRNAs可能在重症肌无力的发病和发展中存在重要的调控作用,并为中药治疗重症肌无力提供了分子理论基础。