【摘 要】
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在前期研究中已经通过电生理膜片钳技术对牛乳酪蛋白酶解物进行活性鉴定,鉴定出牛乳睡眠肽的活性位置判定了其体外活性;并且通过协同戊巴比妥钠实验、大鼠失眠模型判定了牛乳促睡眠肽的在大鼠体内的促睡眠活性。本研究以牛乳促睡眠肽为对象通过优化分离纯化技术分离出牛乳促睡眠肽单体运用多种方式鉴定其结构。同时对牛乳睡眠肽镇静催眠活性及机制进行研究,为牛乳睡眠肽后续产品研发及理论研究提供基础。（1）牛乳睡眠肽的结构鉴
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在前期研究中已经通过电生理膜片钳技术对牛乳酪蛋白酶解物进行活性鉴定,鉴定出牛乳睡眠肽的活性位置判定了其体外活性;并且通过协同戊巴比妥钠实验、大鼠失眠模型判定了牛乳促睡眠肽的在大鼠体内的促睡眠活性。本研究以牛乳促睡眠肽为对象通过优化分离纯化技术分离出牛乳促睡眠肽单体运用多种方式鉴定其结构。同时对牛乳睡眠肽镇静催眠活性及机制进行研究,为牛乳睡眠肽后续产品研发及理论研究提供基础。（1）牛乳睡眠肽的结构鉴定在前期研究的基础上,通过优化醇沉条件对牛乳睡眠肽粗提物进行分离纯化,提高促睡眠活性部位多肽纯度,增强牛乳睡眠肽活性。使用半制备高效液相色谱及分析型高效液相色谱对牛乳睡眠肽单体CCL-3S进行分离,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定CCL-3S并通过MASCOT搜库匹配到酪蛋白序列;再通过蛋白自动测序仪进行辅助N端测序判定CCL-3S的氨基酸结构。牛乳睡眠肽的结构为HQGLPQEVLNENLLR,该单体的分离方法与助眠活性报道均为首次。（2）牛乳睡眠肽镇静催眠作用研究本研究成功复制PCPA致失眠模型,对大鼠体重、摄食、饮水等生理生化指标监测,观察到给予样品后牛乳睡眠肽组、阳性对照组的体重、摄食、饮水量相比于失眠模型组更快恢复到正常状态。各组脾脏脏器系数无显著变化。通过旷场实验研究牛乳睡眠肽对PCPA致失眠大鼠的行为学影响。失眠大鼠在经过牛乳睡眠肽及阳性药物干预之后,与模型组相比大鼠旷场运动总路程显著下降、大鼠旷场中央停留次数显著下降、中央区停留次数显著上升、中央停留时间显著下降;与空白组相比以上指标无显著差异。行为学实验——旷场实验表明,牛乳睡眠肽减少了失眠大鼠在旷场中的焦虑感,具有镇静作用。本研究通过对大鼠下丘脑中神经递质检测,复制PCPA致失眠大鼠模型成功后,给予给样一周后,与模型组相比大鼠下丘脑神经递质5-HT、GABA含量显著上升;牛乳睡眠肽高剂量组Gly含量大于失眠模型组与空白组,且有显著性;DA,NE含量显著下降。表明牛乳睡眠肽可通过调节大鼠下丘脑中的神经递质,从而达到镇静催眠的效果。通过研究下丘脑中神经递质及其代谢产物变化探讨牛乳睡眠肽对失眠大鼠睡眠的调控作用。牛乳睡眠肽高剂量组5-HT显著高于失眠模型组,5-HIAA显著低于空白组,且5-HIAA/5-HT值极显著低于空白组。此结果提示牛乳睡眠肽提升了5-HT含量,同时加速了5-HIAA的代谢。Glu脱羧后的代谢产物为GABA,牛乳睡眠肽组GABA显著高于失眠模型组,Glu/GABA在各组中比值无显著差异,提示牛乳睡眠肽可能作用于GABA氨基酸通路。DA的代谢产物为DOPAC。与空白组相比,失眠模型组大鼠下丘脑中DOPAC含量升高,不具有显著性;牛乳睡眠肽中剂量、低剂量组大鼠下丘脑DA含量,失眠模型组大鼠下丘脑DOPAC含量相比有下降具有显著差异。（3）牛乳睡眠肽促睡眠机制研究牛乳睡眠肽对大鼠下丘脑区VLPO核团C-FOS蛋白表达的变化结构表明:牛乳睡眠肽显著降低了VLPO核团C-FOS蛋白表达,表明牛乳睡眠肽对睡眠-觉醒系统具有调节作用下丘脑转录组学关注到Cyp1b1与AC123346.1两个氨基酸代谢通路中的基因。该结果与神经递质检测结果相互印证,造模药物PCPA为色氨酸羟化酶（TDH）抑制剂,在Trp通路中正常组与牛乳睡眠肽组Cyp1b1相对失眠组显著上调。Gly通路中正常组与牛乳睡眠肽在AC123346.1基因相对失眠组显著上调。在神经递质检测结果中,牛乳促睡眠肽高剂量组Gly显著高于失眠模型组与模型组。AC123346.1是通过牛乳睡眠肽致大鼠失眠实验目前新注释到的基因,有待进一步研究其作用位点与受体。（4）牛乳睡眠肽产品开发及效果研究将药食同源的酸枣仁、百合提取物与牛乳睡眠肽复配拟研究牛乳睡眠肽复合产品。优化酸枣仁、百合连续相变提取条件和喷雾干燥条件,并制备其醇提物。通过行为学、神经递质检测验证其助眠效果。结果表明,给予牛乳睡眠肽产品后体重、摄食、饮水量相比于失眠模型组更快恢复到正常状态。脾脏脏器系数无显著变化。行为学实验——旷场实验表明,牛乳睡眠肽产品减少了失眠大鼠在旷场中的焦虑感,具有镇静作用。
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