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目的:筛选食管癌干细胞及其特异性标志物。方法:采用有限稀释法分离培养食管癌Eca109单克隆细胞株。HE染色观察单克隆细胞株的细胞形态,采用细胞免疫荧光技术及免疫细胞化学法检测干细胞标记物P75NTR、Oct-4、SOX2、Lin28、Nanog在各细胞株中的表达定位。应用平板克隆形成实验及MTT法连续监测7天检测并比较各细胞株的体外增殖情况;检测食管癌Eca109单克隆细胞株在不同浓度化疗药作用48小时后存活比例的比较;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。结果:(1)采用有限稀释法成功获得两种形态的单克隆细胞株,分别为小圆形和短梭形,将小圆细胞、短梭细胞及未分选的Eca109细胞接种于盖玻片上行常规HE染色,显微镜下观察:小圆细胞胞质少,核大、圆形,短梭形细胞核相对较小,胞质丰富。(2)干细胞标记物P75NTR、Oct-4、SOX2、Lin28、Nanog在各细胞株中均阳性表达,其中SOX2、Lin28在三种细胞中表达情况相似,即SOX2荧光均定位于细胞浆,Lin28荧光均定位于细胞核。P75NTR、Oct-4在圆形细胞上荧光定位于细胞的胞核,在梭形细胞上定位于细胞的胞浆。Nanog在圆形细胞上荧光定位于细胞胞浆,在梭形细胞上定位于细胞的胞核。(3)MTT检测结果示圆细胞株增殖率明显高于其他细胞株,差异显著(P<0.001)。圆形、梭形、未分选细胞接种于培养板中培养15天后形成细胞数大于50个的克隆形成率分别为38%、6%、22%,圆形细胞克隆形成的细胞团明显大于其它两种细胞。(4)化疗药物作用24小时后,可见96孔板中培养的食管癌细胞生长受阻,48小时后出现小部分漂浮死亡的细胞,随着药物浓度的增大,细胞死亡比例相对增多,形态也有所改变,发现在浓度较低的卡铂和紫杉醇作用下,梭形细胞和未分选细胞均有少部分细胞死亡,而圆形细胞出现了少量的增殖;在较高浓度药物作用后,梭形细胞和未分选细胞的存活细胞明显减少,圆形细胞表现出较强的耐药性,只有少量的细胞死亡。在化疗药物丝裂霉素C的作用下,三种细胞均有不同程度的死亡,但每个浓度作用下圆形细胞的存活细胞数均比其他两种细胞多。(5)Transwell小室法结果示各单克隆细胞株之间侵袭能力相差不大。结论:(1)食管癌细胞中可能存在食管癌干细胞;(2)干细胞标志物P75NTR、Oct-4和Nanong在细胞中的表达部位不同,推测这两种抗体可能是分选食管癌干细胞的重要标记物。(3)单个细胞克隆分选出的圆形食管癌Eca109细胞具有肿瘤干细胞的特性,其可能是食管癌干细胞。