第一部分HSF1在人垂体促肾上腺皮质激素腺瘤组织标本中的表达及其临床意义目的探究HSF1在人垂体促肾上腺皮质激素腺瘤中的表达及其潜在的临床意义方法从马普学会精神医学中心临床神经内分泌实验室标本库中收集的47例垂体促肾上腺皮质激素腺瘤和4例正常人垂体组织标本纳入此项研究。使用免疫组织化学染色的方法在石蜡组织切片中进行HSF1的染色。使用半定量方法评估组化染色的强度。使用Graph Pad Prism 7.0进行临床数据及HSF1表达水平的统计分析。结果47例垂体促肾上腺皮质激素腺瘤中共3例(6.38%)为男性患者,其余44例(93.62%)皆为女性患者。在39例已知肿瘤直径的病例当中,14例(35.90%)为大腺瘤(平均肿瘤直径15.86±4.67mm),25例(64.10%)为微腺瘤(平均肿瘤直径7.68±1.91mm),其中3例大腺瘤、1例微腺瘤及1例肿瘤直径未知病例为侵袭性肿瘤。主要激素水平如下:上午9点血清皮质醇水平827.2±290.4 nmol/ml,夜晚12点血清皮质醇水平653±347.7 nmol/ml,24小时尿游离皮质醇2488.6±1932.99 nmol/ml,上午9点ACTH水平99.77±52.23ng/ml。4例正常垂体组织及47例ACTH腺瘤中均可检测出HSF1阳性染色细胞。通过半定量分析HSF1的染色强度,26例ACTH腺瘤(55.31%)中HSF1的染色强度高于正常垂体组织,21例ACTH腺瘤(44.69%)中的HSF1染色强度与正常垂体相近。通过统计分析,未能发现HSF1的表达水平与患者性别(p=0.8382)、肿瘤侵袭性(p=0.2374)、上午9点血清皮质醇水平(p=0.4627)、上午9点ACTH水平(p=0.6679)、24小时尿游离皮质醇(p=0.9048)、肿瘤直径(p=0.5581)有显著相关性。结论HSF1在人ACTH腺瘤中差异性表达,但普遍高于正常垂体组织,其表达水平对患者的激素水平及肿瘤特性并没有显著的关联。第二部分HSF1在促肾上腺皮质激素腺瘤细胞模型中的活化状态及其对细胞增殖和激素分泌的影响目的探究HSF1在促肾上腺皮质激素腺瘤细胞模型中的活化状态及抑制HSF1对细胞增殖以及激素分泌的影响方法使用Western Blot和HSE-Luc报告基因检测方法来检测At T20细胞对热休克刺激及HSF1抑制剂KRIBB11的反应。Cell Titer Glo试剂盒及细胞绝对计数的方法用来检测KRIBB11对At T20细胞活性及细胞增殖的影响。流式细胞计数用来检测KRIBB11对At T20细胞周期的影响。Caspase-Glo 3/7试剂盒用来检测KRIBB11对细胞凋亡的影响。Pomc-Luc和Nur RE-Luc报告基因检测方法用来检测KRIBB11对At T20细胞Pomc启动子活性的影响。实时定量PCR用来确定KRIBB11对Pomc转录的影响。放射免疫法用来检测At T20细胞、小鼠原代垂体细胞、人促肾上腺皮质激素腺瘤原代培养细胞上清ACTH的浓度。HSF1小干扰RNA用来确认HSF1抑制剂对细胞活性及ACTH分泌的影响。结果热休克刺激并不影响At T20细胞内HSF1的表达。与对照组相比,KRIBB11刺激会引起HSF1特异性条带下移。热休克刺激可以极大提高HSE的启动子活性,HSP90的N末端抑制剂17-AAG则在非热休克和热休克刺激条件下均提高HSE的启动子活性。KRIBB11处理会降低非热休克和热休克刺激条件下基础状态HSE启动子活性或17-AAG激活的HSE启动子活性。KRIBB11刺激也可以浓度或时间依赖性地降低At T20细胞的细胞活性,IC50为10μM。通过台盼蓝染色细胞绝对计数的方法也确认了KRIBB11对At T20细胞增殖的浓度依赖性抑制性作用。并且KRIBB11诱导At T20细胞G2/M期阻滞。KRIBB11也被发现在非细胞毒性浓度条件下并不影响细胞凋亡进程。KRIBB11可以降低基础状态或地塞米松刺激下的Pomc及Nur RE元件启动子活性,此抑制效应也通过RT-PCR及两条不同序列的HSF1小干扰RNA沉默所确认。此外,KRIBB11浓度依赖性地降低基础状态及小剂量地塞米松刺激下的At T20细胞上清ACTH的分泌,HSF1小干扰RNA沉默也可抑制细胞上清ACTH的分泌。而且,在4例原代培养的人ACTH腺瘤中,KRIBB11抑制了3例ACTH的分泌,但不与地塞米松产生叠加抑制效应。然而KRIBB11并不影响小鼠正常垂体原代培养细胞的ACTH分泌。结论HSF1在基础状态下的At T20细胞系内处于组成性活化状态,其活力可以被正负调节。在At T20细胞中,HSF1特异性抑制剂KRIBB11是通过抑制HSF1的活性来发挥其HSF1抑制作用。KRIBB11可以抑制At T20细胞活性及细胞增殖,诱导G2/M期阻滞,但并不影响细胞凋亡。此外,KRIBB11及HSF1小干扰RNA均可在体外降低促肾上腺皮质激素腺瘤细胞ACTH的分泌。HSF1可以作为库欣病的潜在治疗靶点。第三部分抑制HSF1调节糖皮质激素受体活性反式阻抑POMC的转录目的探讨HSF1抑制对At T20细胞内糖皮质激素受体活性的调节作用方法MMTV-Luc报告基因法和实时定量PCR用来检测GR激动剂地塞米松和HSF1抑制剂KRIBB11对At T20细胞内GR转录活性及表达的影响。细胞总蛋白Western Blot用来检测HSF1失活后GR、HSP70蛋白水平的变化。细胞质蛋白和细胞核蛋白的Western Blot用来检测地塞米松和HSF1抑制剂KRIBB11对At T20细胞内GR胞核转运的影响。HSF1小干扰RNA用来确认HSF1抑制剂对GR活性造成的影响。结果与空白组或单独地塞米松组相比,HSF1抑制剂KRIBB11能提高At T20细胞基础状态或地塞米松诱导下的MMTV报告基因活性,基础状态下的最大效应浓度为10μM,地塞米松诱导下KRIBB11 2.5μM也可提高3.2倍的MMTV报告基因活性。KRIBB11和地塞米松下调At T20细胞的GR转录水平,但延长药物作用时间至24h则可逆转此抑制效应。KRIBB11处理下的At T20细胞内Hsp70和Hsf1基因的转录下降。Western Blot显示KRIBB11可以浓度依赖性的增加GR蛋白表达,但对HSP70蛋白的表达无明显影响。蛋白酶体抑制剂MG132作用下,KRIBB11可以抑制蛋白酶体抑制剂MG132诱导的HSP70蛋白表达的增加,而蛋白翻译抑制剂Cycloheximide作用下,KRIBB11并不影响HSP70蛋白的表达。此外检测细胞质及细胞核组分,KRIBB11并不会增加地塞米松诱导的GR胞核转运效应。两条不同的沉默序列产生的HSF1的暂时沉默也会增加MMTV报告基因的活性、降低GR的转录水平、增加GR的蛋白表达。结论HSF1抑制可以增加糖皮质激素受体的转录活性及蛋白表达,激活GR对其自身基因转录的负反馈调节机制,发挥其对POMC基因的反式阻抑效应。