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研究背景和目的口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,约占口腔癌的90%。不仅危及患者生命,还影响美观和生存质量。尽管近年来采用手术、放疗、化疗及靶向治疗等综合治疗方法,但OSCC的5年生存率仍在50%左右。因此,需要寻找新的治疗方法和治疗靶点,以提高OSCC的疗效。OSCC的发生发展是多种基因相互作用的结果,涉及癌基因的激活和抑癌基因的功能失调,细胞能量代谢信号通路和细胞分化信号通路的异常,以及细胞外环境改变促进肿瘤细胞侵袭转移和免疫逃逸等因素。蛋白质作为基因的编码产物和生物体信号传递的重要载体,其种类和水平的表达异常在肿瘤发生发展中发挥重要作用。近年来蛋白组学(Proteomics)和质谱法(Mass Spectrometry,MS)的发展为研究肿瘤中蛋白的作用提供了条件,研究OSCC中关键蛋白的功能及其互作蛋白网络有助于阐明OSCC发生发展的分子机制,为OSCC的诊断、治疗和预后判断提供帮助。我们课题组前期研究证实成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein alpha,FAP)在OSCC的肿瘤细胞外基质及肿瘤细胞内高表达,并与临床分期及淋巴结转移等密切相关,是独立的预后因子。进一步实验证实,FAP能促进OSCC细胞生长、侵袭和转移;抑制FAP表达,能通过Akt/PI3K信号通路明显抑制口腔鳞癌细胞生长、侵袭和转移。但是FAP在OSCC中确切的作用机制尚不清楚需要进一步的研究。本研究拟在前期研究的基础上,利用免疫共沉淀和质谱结合的方法筛选FAP的互作蛋白,为并候选互作蛋白进行初步互作验证和功能做初步探究,以阐明FAP影响OSCC发生发展的确切的分子机制,为靶向治疗OSCC提供新的思路。方法1.FAP真核表达载体的构建和稳定细胞株的建立利用基因重组技术,将通过逆转录得到的FAP野生型全长插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体中。将重组病毒表达载体(pCDH-FAP)和辅助载体(psPAX2,pMD2.G)共转染工具细胞,收集上清液后感染口腔鳞癌细胞。通过流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)筛选阳性细胞,得到稳定过表达FAP的口腔鳞癌细胞。2.免疫共沉淀联合质谱筛选FAP互作蛋白以及数据库分析候选蛋白提取稳定过表达FAP的口腔鳞癌细胞总蛋白,免疫共沉淀技术以及质谱分析,得到与FAP可能的互作蛋白。根据对质谱结果,利用GO,String等数据库进行生物信息学分析,分析得到FAP互作候选蛋白进行进一步互作验证。3.互作蛋白DPP9初步验证以及初步功能探讨利用标签抗体和免疫共沉淀磁珠进行免疫共沉淀反应,验证候选蛋白DPP9与FAP的物理互作效应。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组化的方法检测OSCC标本和配对的癌旁组织中DPP9的表达情况,以探讨DPP9在mRNA和蛋白水平的表达情况。采用siRNA特异性干扰SCC9中DPP9的表达,qRT-PCR和蛋白质印记(Western Blot,WB)验证干扰效率后,分别利用CCK8检测干扰后细胞活性变化,Transwell分析细胞转移和侵袭的能力变化,以探讨抑制DPP9表达对OSCC细胞生长、侵袭、转移的影响。结果1.过表达FAP的稳定细胞株的构建成功在荧光显微镜下可见绿色荧光表达,流式细胞仪显示绿色荧光阳性率为91.44%,qRT-PCR和Western Blot显示与空白对照组相比,FAP在mRNA和蛋白水平均为高表达。2.免疫共沉淀联合质谱筛选FAP互作蛋白以及数据库分析候选蛋白提取细胞总蛋白,考马斯亮蓝染色证实免疫共沉淀筛选出内源性FAP互作蛋白。将总蛋白酶解后抽提酶解肽段进行ESI质谱,利用软件分析质谱结果鉴定互作蛋白种类,两次独立实验得到相同的24种与FAP可能存在互作关系的蛋白,其中6种蛋白与FAP有相同的GO功能注释,13种蛋白与FAP有共同的亚细胞定位,1种蛋白有相似的结构域。DPP9作为与FAP有共同的细胞定位,相同的GO注释以及类似结构域的蛋白,被选为我们进一步研究的目标蛋白。3.DPP9为FAP互作蛋白,且OSCC中DPP9的表达下降,抑制DPP9会改变SCC9细胞多种功能利用标签抗体和免疫共沉淀磁珠进行免疫共沉淀反应,与IgG对照组相比,在总蛋白裂解液和IP洗脱液中均检测到FAP标签HIS蛋白和DPP9,证实DPP9是FAP的互作蛋白。免疫组化和qRT-PCR结果显示,DPP9在OSCC中表达量低于配对口腔黏膜组织;siRNA抑制SCC9中DPP9的表达,能增强SCC9细胞活性,促进细胞迁移、侵袭。结论1.成功构建重组病毒真核表达载体pCDH-FAP以及稳定过表达FAP的OSCC细胞株;2.通过两次独立的实验获得FAP互作蛋白24个,生物信息学分析后得到,其中与FAP参与共同的生物过程的蛋白有6个,与FAP具有相同结构域的蛋白有1个,与FAP具有相同细胞定位的蛋白有13个;3.DPP9蛋白与FAP在OSCC细胞中存在相互作用,DPP9在OSCC中表达低于配对正常黏膜组织,且抑制DPP9可以增强OSCC细胞株SCC9的细胞活性,促进其侵袭和转移。