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TOLL样受体4与高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛功能的关系研究肥胖是2型糖尿病重要诱发因素,也是代谢综合征的重要组成部分,可以引起体内血脂异常和高游离脂肪酸血症。然而持续高脂饮食诱导的肥胖损伤胰岛beta细胞的确切机制仍不是非常清楚。我们假设,长期高脂饮食诱导的肥胖损伤胰岛beta细胞功能的细胞学机制可能是通过上调beta细胞表面的TLR4,并活化TLR4信号通路,增强下游炎症因子的表达水平,从而损伤beta细胞功能。为了验证上述假设,我们设计了以下三部分试验。第一部分高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型目的:建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型。试验方法:1.雄性8-10周龄C57BJ/L6小鼠40只,随机分为正常饮食组和高脂饮食组,每组20只。普通饲料能量组成:脂肪10%,蛋白质20%,碳水化合物70%。高脂饲料能量组成:脂肪35%,蛋白质20%,碳水化合物45%。2.每两周称取体重,每周计算进食量和引水量,结束时各组小鼠留取血清,称取附睾脂肪重量,和肝脏重量,计算内脏脂肪含量(附睾脂肪/体重)、肝脏含量(肝脏/体重)。3.血糖仪测定血糖,生化方法测定血糖,血脂(TG、TC),酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清胰岛素。4.通过糖耐量试验、胰岛素释放试验、胰岛素耐量试验,来判断胰岛素敏感性以及β细胞功能。5.高脂组和对照组小鼠分别于4周末,12周末,24周末处死(n=5);取上述六组肝脏病理HE染色,光镜下观察脂肪变性,并TUNEL法检测肝脏凋亡变化。结果:1.相比于对照组,高脂组小鼠体重、内脏脂肪含量(附睾脂肪/体重)、肝脏含量(肝脏/体重)都明显升高,尤其在高脂喂养12周后出现显著差异,并且差异持续存在至本次试验终点24周末。2.高脂组小鼠空腹血浆血糖、空腹血清胰岛素水平、以及血脂(TC、TG)都明显升高,高于对照组;高脂组肝脏、肌肉以及胰腺组织中甘油三脂含量也显著高于对照组。3.相比于对照组,高脂组小鼠胰岛素耐量减退,胰岛素敏感性下降,葡萄糖刺激的急性胰岛素分泌能力减低。4.随着高脂饮食时间的延长,肝脏逐渐出现弥漫性脂肪变性,高脂12周组重于高脂4周组(HF4),高脂24周组(HF24)重于高脂12周组(HF12), HF24组肝脏出现大量的脂滴沉积,以小叶中心静脉周围最为明显,肝细胞体积增大,胞浆中有大量脂滴空泡,核居边,且小叶内有炎症细胞浸润。对照组肝细胞排列规则,未见脂滴沉积,无炎症细胞浸润。TUNEL法检测发现高脂组小鼠肝细胞凋亡明显而对照组未出现肝细胞凋亡。结论:高脂饮食成功诱导了肥胖胰岛素抵抗的小鼠模型,其体重、肝脏含量(肝脏/体重)、内脏脂肪含量(附睾脂肪/体重)、血脂(TC、TG)、空腹血糖,血浆空腹胰岛素水平都明显升高,葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损,胰岛功能受损;肝脏脂肪变性显著,随着喂养时间延长脂肪变性更为明显,并且肝细胞出现凋亡。由于高脂饮食模拟了人类饮食的特点,为研究高脂对于胰岛功能的影响创造了条件。因此,高脂诱导的肥胖胰岛素抵抗模型是深入研究胰岛beta细胞功能的理想试验动物模型。第二部分TLR4在高脂诱导的肥胖小鼠胰岛中的表达目的:观察TLR4在高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛中的差异表达,游离脂肪酸(palmitate)刺激后小鼠胰岛瘤细胞系MIN6中TLR4的表达,明确肥胖,高游离脂肪酸损伤胰岛beta细胞功能同beta细胞TLR4表达之间的关系。方法:1.将40只C57BJ/L2小鼠随机分2组,每组20只(方法同第一部分)。2.用免疫组化的方法检测高脂24周组(HF24)和对照24周组(ND24)组胰腺组织中胰岛insulin、TLR4的表达。3.培养小鼠胰岛瘤细胞系MIN6,分别用游离脂肪酸(Palmitate)和BSA刺激24小时,观察insulin分泌变化。4.小鼠胰岛瘤细胞系MIN6,分别用游离脂肪酸(Palmitate)和BSA刺激前,后2,4,5,6小时观察TLR4 mRNA表达变化以及IL-6mRNA,TNFamRNA以及MCP-1mRNA的表达变化。结果:1.免疫组化证实,胰岛中insulin染色阳性的细胞中存在TLR4的表达,并且高脂组小鼠胰岛内TLR4的表达水平显著高于对照组。2.培养胰岛瘤细胞系MIN6给予游离脂肪酸(palmitate)刺激,相比于BSA组,持续游离脂肪酸(palmitate)刺激刺激24小时后胰岛素的分泌显著减少。3.相比于BSA组,小鼠胰岛瘤细胞系MIN6,分别用游离脂肪酸(Palmitate)刺激2,4,5小时后TLR4 mRNA水平随着刺激时间的延长而升高,6小时后TLR4 mRNA水平减低,并且促炎因子IL-6mRNA,TNFamRNA,MCP-1mRNA水平在游离脂肪酸(Palmitate)刺激2,4,5小时后也显著升高,6小时后下降。结论:持续高脂饮食能够诱导胰岛beta细胞中TLR4的表达上调。在体外胰岛瘤细胞系MIN6的培养中发现,持续游离脂肪酸(palmitate)刺激24小时,insulin分泌功能减退,而随着游离脂肪酸刺激的时间延长,TLR4mRNA和促炎因子IL-6 mRNA,TNFamRNA,MCP-1mRNA的表达水平均升高,表明高脂饮食和高游离脂肪酸持续刺激能够上调胰岛beta细胞上的TLR4的表达,并促进TLR4信号通路中下游的促炎因子IL-6,TNFa, MCP-1的表达升高。提示游离脂肪酸(palmitate)刺激的insulin分泌功能减退相关可能同胰岛beta细胞表面的TLR4表达上调相关。第三部分TRL4敲除保护高脂饮食诱导的肥胖小鼠胰岛功能的机制研究目的:研究TLR4敲除转基因小鼠高脂饮食后抵抗肥胖,保护胰岛功能的机制以及TLR4信号通路同游离脂肪酸(palmitate)刺激胰岛素分泌之间的关系,初步阐明肥胖,慢性游离脂肪酸损伤胰岛beta细胞的功能可能通过上调beta细胞表面的TLR4,并活化TLR4信号通路,增强下游炎症因子的表达水平而实现的。方法:1.高脂饲料成份同第一部分,相同的高脂饲料(HFD)分别饲养野生型(SNF)小鼠和TLR4敲除(NJ)小鼠,并各设正常饮食(ND)作为对照组,持续喂养24周。2.每两周称量体重,每周计算进食量和引水量,结束时留取血清,称量附睾脂肪重量,和肝脏重量,计算内脏脂肪含量(附睾脂肪/体重)、肝脏含量(肝脏/体重)。3.测定空腹血糖,空腹胰岛素,血脂,测定胰岛素敏感性试验、葡萄糖耐量试验、胰岛素释放试验,评价TLR4敲除(NJ)小鼠胰岛beta细胞功能。4.本次试验终点24周末处死四组小鼠(SNJ HF组,SNJ ND组,NJ HF组NJ ND组)取肝脏组织病理HE染色,观察不同组间肝脏脂肪变性差异。4.观察各组肝脏和胰腺油红染色,以及各组间胰岛电镜超微结构的变化。5.从高脂诱导的TLR4敲除(TLR4-/-)小鼠和野生型小鼠中分离原代胰岛细胞给予静态培育观察胰岛功能变化,并抽提RNA行realtime PCR检测IL-6,TNFa等炎性因子的表达。结果:1.高脂SNJ(SNJ HF)组小鼠出现脂肪肝的变化类似于第一部分,SNJ HF组小鼠出现空腹血糖升高,高胰岛素血症,葡萄糖耐量减低,胰岛素的敏感性下降,并且葡萄糖刺激的急性胰岛素的分泌显著减低,而面对同样的高脂饮食持续喂养24周,高脂TLR4-/-(NJ HF)组小鼠能够抵抗肥胖,胰岛素敏感性增强,胰岛分泌功能受保护,葡萄糖刺激的急性胰岛素的分泌功能受到保护,。2.面对同样的高脂饮食持续喂养24周,高脂TLR4-/-(NJ HF)组小鼠肝脏,肌肉和胰腺组织甘油三脂含量显著低于SNJ HF组。3.24周末,NJ HF组肝脏体积显著大于NJ ND组,肝脏表面呈现暗黄色,边缘圆钝,切面油腻,而NJ HF组肝脏色泽偏红,边缘锐利。光镜下,SNJ HF组肝细胞弥漫性脂肪变性,小叶内有炎症细胞浸润。NJHF组肝细胞排列基本正常,无脂滴和未见肝细胞脂肪变性。4.肝脏和胰腺油红染色显示,高脂SNJ组小鼠肝细胞脂肪变性严重,肝脏被红染的脂滴区域明显增多,存在大量脂滴红染区域,NJ HF组未见明显的脂滴红染区,其背景肝细胞排列基本规则。SNJ HF组胰腺组织表面出现大量的红染区域,呈现红色油滴状,背景胰腺组织排列基本规则,而NJ HF组胰腺组织未见明显的脂滴红染区,5.SNJ HF组小鼠胰岛电镜超微结构显示beta细胞内脂滴空泡明显增多,胰岛素分泌囊泡数量减少,并且伴有线粒体肿胀;而高脂TLR4敲除NJ组小鼠beta细胞无上述改变,其形态接近于正常饮食组beta细胞。6.原代胰岛分离后静态培育显示,持续高脂喂养24周野生型小鼠SNJ HF组原代胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)降低,显著低于TLR4敲除的NJ HF组小鼠。NJ HF组胰岛炎症因子IL-6,TNFa,MCP-1mRNA水平显著低于野生型小鼠。结论:本研究从活体动物水平和细胞水平研究了TOLL样受体4在胰岛分泌功能中的地位及作用,发现高脂饮食可以上调TLR4在胰岛中的表达,活化TLR4信号通路,增强下游炎症因子的表达水平;并发现TLR4信号通路的活化同胰岛beta细胞的分泌功能损伤密切相关。TLR4敲除后小鼠能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖,并且保护胰岛功能。持续的游离脂肪酸(palmitate)刺激损伤胰岛素分泌,并且增强TLR4的表达,活化TLR4信号通路,提示胰岛beta细胞的胰岛素分泌功能同TLR4密切相关,TLR4敲除能够保护胰岛beta细胞的分泌功能。动物水平和细胞水平结果表明:慢性游离脂肪酸刺激损伤胰岛beta细胞功能的细胞学机制可能是通过上调beta细胞TLR4表达水平,进而活化TLR4信号通路来实现的。