目的:利用人卵巢癌细胞系、IL-17A缺陷小鼠(IL-17A-/-小鼠,deficient)及同基因小鼠卵巢癌细胞系、临床卵巢癌组织标本系统地探讨IL-17A(Interleukin-17A)对卵巢癌(ovarian cancer,OVCA)顺铂(cisplatin,DDP)耐药的影响及其可能的作用机制,为临床降低OVCA化疗耐药提供新的策略。方法:1.应用Western Blotting法检测人OVCA细胞系A2780(DDP敏感OVCA细胞株)、OVCAR3(DDP耐药OVCA细胞株)和小鼠OVCA细胞系ID8(C57BL/6背景)中IL-17A受体(IL-17RA)的表达。2.应用MTT法检测rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞增殖的影响。3.应用MTT法检测DDP对A2780和OVCAR3细胞的IC50。4.应用Western Blotting法检测不同剂量rhIL-17A处理不同时间对A2780和OVCAR3细胞中耐药相关分子ABCG2和MDR1表达的影响。5.应用MTT法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对A2780和OVCAR3细胞DDP(A2780,10μM;OVCAR3,100μM)耐药(药敏)的影响,并以rhIL-17RA中和抗体(IL-17RA mAb)和Gli1抑制剂Gant61进行相应的封闭实验。6.设计和合成三对IL-17RA的特异性siRNA序列(#1、#2、#3 siIL-17RA),利用Lipofectamine TM 2000转染A2780和OVCAR3细胞。利用Western blotting法鉴定IL-17RA敲降效果。7.应用MTT法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对#3 siIL-17RA序列转染的A2780和OVCAR3细胞DDP(A2780,10μM;OVCAR3,100μM)耐药(药敏)的影响。8.应用流式细胞仪,采用Annexin V-FITC/PI双染法,检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞(A2780,10μM;OVCAR3,100μM)凋亡的影响,并以rhIL-17RA中和抗体(IL-17RA mAb)进行相应的封闭实验。9.应用Western Blotting法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)处理A2780和OVCAR3后,对细胞中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Hedgehog(Hh)信号通路核转录因子Gli1的表达的影响,并分别以IL-17RA mAb和Gant61进行相应的封闭实验。10.应用Western Blotting法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对#3 siIL-17RA转染后的A2780和OVCAR3细胞中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1表达的影响。11.以C57BL/6野生型(wild type,WT)、IL-17A缺陷型(deficient,IL-17A-/-)小鼠和小鼠卵巢癌细胞系ID8建立小鼠OVCA腹腔种植瘤动物模型,并给予DDP治疗,检测内源性IL-17A对顺铂治疗OVCA疗效的影响。分别取出顺铂治疗后WT组小鼠(“WT+DDP”)和IL-17A-/-组小鼠(“deficient+DDP”)两组肿瘤组织,应用IHC技术观察瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达。再分别从WT组小鼠,IL-17A-/-组小鼠,“WT+DDP”组小鼠,“deficient+DDP”组小鼠四组肿瘤组织中提取蛋白,应用Western Blotting法观察瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达。12.收集55例上皮性OVCA(epithelial OVCA,EOC)患者的病理组织标本和9例正常人卵巢的组织标本,采用IHC法分析IL-17A表达与ABCG2、MDR1、Gli1的表达及与患者临床进展等的相关性。结果:1.人OVCA细胞系A2780、OVCAR3和小鼠OVCA细胞系ID8均表达IL-17RA(如图1A所示)。2.rhIL-17A对A2780和OVCAR3的细胞增殖无显著性影响(如图1B所示)。3.A2780和OVCAR3细胞的IC50分别为25.78μM和322.00μM(如图2所示)。4.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)可显著增加A2780和OVCAR3细胞耐药相关分子ABCG2和MDR1的蛋白表达水平(如图3所示)。5.#3 siIL-17RA序列转染A2780和OVCAR3细胞后,可显著降低IL-17RA的表达(如图5A所示)。6.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对A2780和OVCAR3细胞活性无显著性影响,但可显著增加DDP降低的A2780和OVCAR3细胞活性(A2780:0.72±0.01 vs 0.49±0.02;OVCAR3:0.75±0.01 vs 0.55±0.04,P<0.05),并且分别以IL-17RA mAb、IL-17RA siRNA或Gant61进行阻断实验均可消除由rhIL-17A加剧的A2780和OVCAR3细胞DDP的耐药性(IL-17RA mAb封闭实验,A2780:0.44±0.01 vs 0.72±0.01,P<0.01;OVCAR3:0.63±0.01 vs0.75±0.01,P<0.05,如图4所示;IL-17RA siRNA封闭实验,A2780:0.82±0.01vs 0.51±0.03,P<0.01,OVCAR3:0.85±0.01 vs 0.77±0.04,P<0.05,如图5B所示;Gant61封闭实验,A2780:0.48±0.02 vs 0.72±0.01;OVCAR3:0.41±0.01 vs 0.75±0.01,P<0.01,如图7C所示)。7.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对A2780和OVCAR3细胞凋亡无显著性影响,但可显著降低DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡(凋亡率A2780:25.77±3.31%vs 1.03±0.67%;OVCAR3:19.20±0.98%vs 0.63±0.15%,P<0.01),并且IL-17RA mAb可消除rhIL-17A降低的A2780和OVCAR3细胞DDP诱导的凋亡(A2780:14.97±0.80 vs 24.77±2.51%;OVCAR3:11.67±1.90 vs 17.97±0.72%,P<0.05)(如图6所示)。8.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)可以促进A2780和OVCAR3细胞耐药相关分子ABCG2,MDR1和Gli1的蛋白表达水平的增加,并且分别以IL-17RA mAb、IL-17RA siRNA或Gant61进行阻断实验均可消除由rhIL-17A引起的A2780和OVCAR3细胞中ABCG2,MDR1和Gli1蛋白表达水平的增加(如图7所示)。9.以DDP处理ID8-荷瘤WT小鼠和IL-17A-/-小鼠,结果显示:(1)“WT+DDP”组小鼠的腹腔内成瘤数目显著大于“deficient+DDP”组小鼠(如图8所示);(2)IHC结果显示“WT+DDP”组小鼠肿瘤组织切片中IL-17A的表达呈强阳性,而“deficient+DDP”组小鼠肿瘤组织切片中未见到IL-17A的表达,并且“WT+DDP”组小鼠肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的表达均高于“deficient+DDP”组小鼠肿瘤组织中相应分子的表达(如图9A所示);(3)Western Blotting结果显示WT组小鼠中的耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的蛋白表达均显著高于IL-17A-/-组小鼠肿瘤组织中相应的蛋白表达,且“WT+DDP”组小鼠肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的蛋白表达均高于WT组小鼠肿瘤组织中相应蛋白的表达,而“deficient+DDP”组小鼠和IL-17A-/-组小鼠肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的蛋白表达无显著性差异(如图9B所示)。10.卵巢癌的临床病理切片分析结果显示:IL-17A表达的强弱与FIGO分期呈正相关(如图10所示);ABCG2、MDR1和Gli1的表达强弱均与FIGO分期呈正相关(如图11A所示);IL-17A表达的强弱也与ABCG2、MDR1和Gli1的表达强弱呈正相关(如图11B所示)。结论:通过临床标本、动物实验及体外机制研究,本课题组发现IL-17A可通过激活Gli1介导的Hh信号通路增加耐药相关分子ABCG2和MDR1的表达,从而加剧以DDP为基础的OVCA化疗药的耐药性。该结果可为临床降低OVCA化疗耐药性提供新的策略。