T-2毒素诱导凡纳滨对虾肌肉品质典型性状的变化规律

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T-2毒素是单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种,广泛存在饲料中,不仅通过水产食物链蓄积引发食品安全问题,更重要的是导致对虾品质变化,从而造成对虾产业的产量下降和经济效益受损。但是目前仍缺乏T-2毒素对凡纳滨对虾肌肉品质影响的评价指标。因此,本研究以T-2毒素诱导的凡纳滨对虾为研究对象,探明T-2毒素诱导的凡纳滨对虾肌肉品质变化的典型性状指标及其变化规律。本论文实验分四部分,⑴染毒技术的建立:通过不同方式将T-2毒素添加到对虾饲料中,并采用LC-MS/MS检测T-2毒素毒饵料的包埋率和载毒量,从而确定毒饵料的制备方法;通过急性毒性实验得到T-2毒素对凡纳滨对虾的口服LD50;⑵从酶学角度出发,研究T-2毒素急性诱导凡纳滨对虾肌肉的Ca2+-ATPase和多酚氧化酶(PPO)的变化规律,从而确定T-2毒素的安全范围和有效量范围,为T-2毒素限量标准提供理论依据和参考;根据T-2毒素对凡纳滨对虾肌肉的病理切片的观察,初步了解T-2毒素对凡纳滨对虾肌肉的损伤情况;⑶根据LD50进行T-2毒素蓄积毒性的剂量分组,分别分为对照组,添加0.5、1.2、2.4、4.8、12.2ppm (mg·kg-1·饲料) T-2毒素的五个试验组,喂养20天,研究饲料中添加T-2毒素对凡纳滨对虾机体生长状况、肌肉化学成分、肌肉酶学指标和肌肉感官品质的影响;⑷通过灰色关联度分析方法找出T-2毒素对凡纳滨对虾作用后的肌肉品质典型性状,并拟合出典型性状随饲料中T-2毒素剂量变化的剂量-效应关系曲线,得到T-2毒素对各典型性状的半数效应量(ED50),一方面从检测品质上提供T-2毒素污染评价指标,另一方面从T-2毒素限量标准上提供理论依据和参考。主要结果如下:1.分别采用标液挥干、标液和标液加水三种方式将T-2毒素添加到对虾饲料中,结果T-2毒素在饲料中的包埋率分别为84.95%、0%和65.32%,所以最终确定采用标液挥干的方式将T-2毒素添加到对虾饲料中;饲料中分别添加10、20、40、80、160ppm(mg·kg-1·饲料) T-2毒素,投放到对虾养殖环境中24h后吸出残渣并取养殖水,测得样品中毒素含量,发现饲料中T-2毒素在80ppm以内,载毒量稳定;通过T-2毒素对凡纳滨对虾急性毒性实验发现,凡纳滨对虾的死亡数量不与T-2毒素剂量呈线性关系,说明凡纳滨对虾对T-2毒素的易感性不一致,通过T-2毒素剂量与凡纳滨对虾死亡率关系的拟合曲线得到T-2毒素对凡纳滨对虾7d的口服LD50为1.2162mg·kg-1·bw。2.根据凡纳滨对虾肌肉Ca2+-ATPase活性与T-2毒素剂量的剂量-效应曲线,得到T-2毒素的ED50为3.22mg·kg-1·bw,ED95为7.52mg·kg-1·bw,ED99为7.96mg·kg-1·bw,SF为0.03mg·kg-1·bw,CSF为0.02mg·kg-1·bw;同样地,根据PPO活性与T-2毒素剂量的剂量-效应曲线,得到T-2毒素的ED50为0.05mg·kg-1·bw,ED95为2.40mg·kg-1·bw,ED99为8.00mg·kg-1·bw,SF为0.08mg·kg-1·bw,CSF为0.02mg·kg-1·bw;综上可知,低剂量时,肌肉的PPO活性对T-2毒素更为敏感,而高剂量时,肌肉的Ca2+-ATPase对T-2毒素敏感性更高,并且确定安全系数CSF均为0.02mg·kg-1·bw;从肌肉横纵切面图可以看出,T-2毒素低剂量时,肌肉的肌节间隙相对于对照组变小,肌纤维也更平整,T-2毒素高剂量时,肌肉肌节变大,肌纤维小片化严重,最后呈溶融状态。3.⑴从机体性能看,T-2毒素对凡纳滨对虾的体重和肌肉重影响极显著,对体长、含肉率影响显著,而对肝胰腺重和肝重比影响不显著;⑵从肌肉感官指标看,T-2毒素对凡纳滨对虾肌肉的感官评价、质构特性、色差属性和蒸煮损失影响均不显著;从肌肉组织的电镜观察可知,T-2毒素能使肌纤维Z带、I线溶解,肌纤维小片化,最后呈现溶融状态;肌肉组织的病理切片变化形态与急性毒性组织样本的变化形态相类似,说明凡纳滨对虾受到T-2毒素污后肌肉组织会进行多次修复,直至肌肉组织被T-2毒素完全破坏;由SDS-PAGE可知,0.5ppm和12.2ppmT-2毒素会诱导凡纳滨对虾产生新蛋白,分子量在55KDa70KDa、35KDa40KDa;⑶从肌肉的化学组成看,T-2毒素对凡纳滨对虾肌肉的粗蛋白、巯基、胶原蛋白含量影响极显著,对灰分含量影响显著,而对水分含量和粗脂肪含量影响不显著;⑷从肌肉营养组成看,T-2毒素对半胱氨酸影响不显著,对赖氨酸影响显著,对其它15种氨基酸、总氨基酸、必需氨基酸、半必需氨基酸、虾味氨基酸和鲜味氨基酸含量影响极显著;根据AAS,无论对虾是否受到T-2毒素污染,凡纳滨对虾肌肉的第一限制性氨基酸均为亮氨酸;根据EAAI,低剂量T-2毒素刺激凡纳滨对虾肌肉的必需氨基酸指数升高,而高剂量T-2毒素使凡纳滨对虾肌肉的必需氨基酸指数降低;⑸从肌肉酶学指标看,T-2毒素剂量在012.2ppm范围内,肌肉的Ca2+-ATPase活性呈现上升-下降-上升变化趋势;PPO活性呈现下降-上升-下降变化趋势,再一次说明凡纳滨对虾对T-2毒素易感性不一致;T-2毒素对肌肉AST活性影响不显著,对ALT活性影响显著,随T-2毒素剂量与ALT活性呈正相关。4.根据灰色关联度分析法,得到与饲料中T-2毒素剂量最为相关的各种类型肌肉品质指标分别为肝重比、熟制肌肉的内聚性、胶原蛋白含量、丝氨酸含量和ALT活性;各典型性状指标与T-2毒素剂量的拟合公式分别为y=-85137+85237·(1+10-0.15·(20+x))–1,y=-105683+105783·(1+10-0.13·(24.7+x))–1,y=-146558+146654·(1+10-0.46·(6.98+x))–1,y=-187680+187778·(1+10-0.15·(22.29+x))–1,y=-110353+110459·(1+10-0.08·(38.53+x))–1,各指标的ED50分别为1.45、1.54、0.70、1.33、1.69mg·kg-1·feed;其中胶原蛋白含量的ED50最低,对T-2毒素最敏感,而其它典型性状的ED50差异不大,在1.331.69mg·kg-1范围之内。
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