论文部分内容阅读
本研究以大鼠为实验对象、自体股薄肌游离移植为实验模型,首先以荧光定量RT-PCR的方法检测肌肉移植后终板区乙酰胆碱能受体（nAChR）γ和ε亚单位基因表达的动态演变,之后以免疫组化和Western杂交的方法定性和定量的研究了肌肉移植后终板区神经源性聚集蛋白（agrin）的分布变化;应用重叠剪切延伸RT-PCR法构建携带神经源性agrin基因片段的表达载体,原代培养了大鼠的成肌细胞,并在体外细胞水平进行了转染实验,通过RT-PCR和双重免疫荧光标记的方法鉴定出具有促进乙酰胆碱能受体簇集生物学活性的神经源性AGRIN-Y4Z8基因克隆（国外学者惠赠）;以此为基础,在体内实验中确定了基因转染的最佳电刺激参数并测定了转染效率,后将携带AGRIN-Y4Z8基因的质粒直接注射入移植肌肉终板区附近并以电击辅助转染,在术后不同时间运用生理学、组织形态学、病理学、分子生物学、神经生物学、免疫学等方法手段,从细胞、生理和分子等不同水平对移植肌肉收缩功能恢复以及运动终板的再生重建情况和进行研究,结果证实: ①肌肉游离移植后,应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测到终板区nAChRε和γ亚单位基因的表达发生动态的变化;终板区神经源性agrin则经历明显减少到缓慢恢复的过程,到术后30周时肌肉内神经源性agrin的表达仍不能恢复到移植前的水平,而这可能是运动终板重建延迟以及重建达不到术前水平的重要影响因素之一,由此间接影响到移植肌肉功能的恢复。 ②构建的神经源性agrin-Y4Z8基因克隆成功转染原代培养的成肌细胞,并能在基因水平转录mRNA,但却不能分泌表达神经源性的agrin蛋白,主要与克隆基因上游缺乏编码信号肽的序列有关;只有转染阳性对照组AGRIN-Y4Z8基因的成肌细胞才能表达分泌有促进nAChR聚集活性的agrin。 ③移植肌肉内电转染1次神经源性agrin基因,最短能在移植术后15周内持续表达agrin;补充神经源性的agrin后,促进了移植肌肉术后早期收缩功能的恢复（4、5、10周）,其机制可能与实验组ε-AChR受体数量的增多和终板结构的完善有关。