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生物支架材料作为骨损伤治疗的载体,加载种子细胞后形成细胞复合材料,移植到骨损伤部位,通过种子细胞不断增殖以及分泌因子等作用,诱使种子细胞向成骨细胞分化,同时生物材料在体内生物降解,从而达到修复骨损伤的目的。骨损伤治疗中,种子细胞和载体材料是研究的热点和难点,干细胞具有自我更新和分化特性,已逐渐成为修复和治疗包括骨损伤、系统性红斑狼疮、贫血等病理性病变和生理性退变的重要手段,临床应用的主要问题是来源受限；骨损伤治疗中支架材料应具有无毒、适宜的力学支架结构、可稳定持续完全降解、良好的生物相容性等,目前已知单一材料很难达到这种要求,本研究以魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan, KGM)、透明质酸(Hyaluronic acid, HA)、羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)、β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)以及壳聚糖(Chitosan, CS)为原料制备的复合材料满足骨组织工程的要求。因此,以复合支架材料为载体,加载干细胞治疗骨损伤,探讨细胞复合材料对骨损伤的修复和治疗作用,具体研究内容及结果如下：1. KGM/HA和HAP/β-TCP/CS复合支架材料的制备：(1) KGM/HA复合支架材料的制备：以KGM和HA为主要原料,在室温下采用共混法和溶胶-凝胶法制备KGM/HA复合凝胶,经水浴熟化和低温冷冻后,冻胶冷冻干燥即得KGM/HA复合支架。利用SEM方法对复合支架微观结构进行分析；借助光学显微技术、扫描电镜、浸渍实验以及联合细胞培养等测定复合支架的孔隙率、孔径大小、抗压强度、体外降解率以及复合支架与干细胞相容性。结果显示：KGM/HA复合支架为三维网络状结构,孔隙率在70～90%之间,主要孔径介于150～250μm之间,其中介于100～250μm的孔径约占80～90%,抗压强度约为0.4MPa；支架中KGM通过脱乙酰基交联形成三维网络结构,HA与KGM之间形成一定量氢键；复合支架具有较好的生物降解性,12周可以降解30%左右,降解率随KGM含量的增加而降低；支架与iMS联合培养结果显示支架具有较好的细胞相容性,细胞相容性随支架中HA比例的增加而降低。(2) HAP/p-TCP/CS复合支架材料的制备：经湿法合成HAP,用浆料浸渍发泡法制备HAP/β-TCP支架,然后将支架浸渍到壳聚糖乙酸溶液中,经数分钟抽真空后,得到附有壳聚糖溶液的支架,经恒温烘干后得到复合支架。用化学计量的碳酸钠溶液除去支架中的乙酸后放入2℃的蒸馏水中浸渍除去残余的盐,37℃恒温烘干即得到HAP/β-TCP/CS复合支架。结果显示：HAP/β-TCP/CS复合骨支架为三维连通多孔结构,平均孔隙率约为83%,孔径主要分布在50μm-400μm之间,抗压强度约为1.38MPa。降解特性研究结果显示HAP/β-TCP/CS在体外降解主要分为两个阶段：第一个阶段是附着在最外面的CS降解和β-TCP降解；第二个阶段指第九周以后,主要是HAP的降解,但HAP的降解速度很慢,到第十二周时还不能降解完全,而CS和β-TCP则可在九周内全部降解。2.卵母细胞提取物诱导成体细胞重编程为诱导性多能干细胞：本研究利用鱼卵母细胞提取物为重编程诱导剂,以成体成纤维细胞为源细胞,通过体外共培养诱使成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced multipotent stem cells,iMS细胞)。免疫组织化学和流式细胞方法检测了诱导细胞表面抗原的变化；实时定量PCR技术检测了相关多潜能基因表达水平的变化；体外定向诱导和裸鼠皮下成瘤实验分析了诱导细胞分别在体内和体外分化潜能；用结合重亚硫酸盐测序法检测干细胞多潜能相关基因启动子区域甲基化水平；用Western Blot方法检测与维持干细胞特性相关通路中关键蛋白的磷酸化水平。结果显示：随着诱导剂浓度的增加和诱导时间延长,细胞形态逐渐发生变化,由梭形变为不规则,细胞体积逐渐增大；细胞表面抗原检测结果显示干细胞标志基因Oct3/4、Sox-2、Nanog和c-Myc在诱导细胞内均为阳性表达；体外定向诱导和畸胎瘤组织切片结果分别显示诱导细胞可向成骨细胞、脂肪细胞和神经以及血管、神经、肌肉和脂肪等组织分化；半定量PCR和实时荧光定量PCR结果显示干细胞多潜能基因Oct3/4和Nanog均在诱导72小时时表达水平最高；DNA甲基化水平结果显示Oct3/4和Nanog基因启动子区域四个位点的DNA甲基化程度均比对照组低,表明诱导细胞内这两个基因表达活性增强；Western Blot结果显示诱导细胞内p38、AS160和β-catenin三种蛋白磷酸化水平增加或出现磷酸化修饰,表明诱导细胞内三种蛋白分别参与的通路上调或开放。3.细胞-支架复合材料的生物相容性及对骨损伤的修复和治疗研究：将诱导细胞即iMS细胞分别与KGM/HA和HAP/β-TCP/CS两种复合支架进行联合培养,采用MTT法检测细胞在支架材料上的增殖情况；用SEM法检测了种子细胞与复合材料的粘附情况；通过体外共培养观察细胞与材料的生物相容性；通过将细胞-支架复合材料移植到骨缺损动物模型损伤部位,采用X-ray、组织切片以及SEM等方法观察细胞成骨和材料降解情况。结果显示：将KGM/HA和HAP/β-TCP/CS两种复合材料分别与iMS细胞进行体外联合培养,结果表明iMS细胞均能较好粘附于支架表面并向孔内生长,将细胞-支架复合材料接种于昆明鼠皮下,接种部位无炎症细胞出现,且支架材料均可降解。将iMS细胞-HAP/β-TCP/CS支架复合材料移植到狗桡骨缺损部位,6个月后缺损部位可显示有新骨生成,表明iMS细胞联合HAP/β-TCP/CS支架对骨损伤有修复和治疗作用。将iMS细胞-KGM/HA支架复合材料移植到兔桡骨缺损部位,8周后,缺损部位可见修复现象,但移植12周与移植8周时损伤部位修复效果无明显差异,表明KGM/HA复合材料在骨缺损修复过程中具有骨传导作用,但无明显骨诱导特性。综上所述,两相复合材料支架KGM/HA和三相多孔复合材料支架HAP/βTCP/CS,两种复合材料均具有较高的空隙率和孔径分布以及良好的生物相容性；利用鱼卵母细胞提取物作为成体成纤维细胞的诱导因子诱使其重编程为诱导多能干细胞,所建立的重编程方法为治疗机体组织损伤和修复的种子细胞来源提供了新的途径；通过研究细胞-支架复合材料对骨损伤部位的修复和治疗作用,初步建立了以iMS细胞为种子细胞联合复合材料支架治疗和修复骨损伤的动物模型,为今后开展临床试验研究提供重要的科学依据和理论数据。