目的:肝细胞癌占原发性肝癌的90%,是一种致死率高、预后较差的癌症。目前用于治疗肝癌晚期的一线药物是索拉非尼和伦瓦替尼。然而研究表明,经索拉非尼治疗后,肝癌患者的中位生存期仅增加了2-3个月。并且部分肝癌患者对索拉非尼产生了一定的耐药性,从而严重削弱了索拉非尼的抗癌效果。因此,通过联合安全成熟的临床药物,克服机体对索拉非尼的耐药性,从而有效地提高肝癌临床治疗的效果,十分具有临床应用价值。青蒿琥酯作为一种抗疟特效药,现已发现对多种癌细胞有一定的杀伤作用,且在联合抗癌药物中表现出明显的协同效果,然而青蒿琥酯是否可以有效提高索拉非尼治疗肝癌的临床效果,有待进一步研究。本课题旨在通过细胞和裸鼠实验,研究青蒿琥酯联合索拉非尼促进肝癌细胞死亡从而抑制肝癌协同作用和相关分子机制。方法:首先,在肝癌细胞中分别单独或联合使用索拉非尼和青蒿琥酯,检测肝癌细胞的死亡形式;其次,通过检测线粒体、溶酶体功能以及铁死亡相关蛋白的表达,阐明联合用药抗肝癌的分子机制;最后,利用裸鼠肝癌移植瘤的体内实验模型,通过检测联合治疗后移植瘤生长大小、铁死亡相关通路在肿瘤组织的活性水平,从而验证联合用药于实验动物体内的治疗效果。1.对细胞生长和死亡的研究:利用MTT法评价细胞增殖能力;流式细胞仪检测sub G1比例和Propidium Iodide（PI）染色试验的指标来评价联合用药诱导肝癌细胞死亡的作用;克隆形成试验评价联合用药对细胞克隆增殖能力的影响。2.对细胞铁死亡作用的研究:使用铁死亡相关抑制剂如脂质过氧化抑制剂、铁螯合剂和其他死亡抑制剂对细胞死亡方式进行评价;然后采用Bodipy581/591C11测定脂质过氧化水平;用相应的检测试剂盒测定脂质过氧化代谢产物MDA的产生量。3.对线粒体功能的研究:细胞处理后,用DCF或Mito SOX red分别测定细胞内总ROS和线粒体内ROS水平;TMRM检测线粒体膜电位的变化;用生化测定法检测细胞ATP水平;用Seahorse代谢仪测定线粒体呼吸氧气消耗率（OCR）。4.对溶酶体功能的研究:免疫蛋白印迹法分析药物联合处理在Bafilomycin A1（溶酶体功能抑制剂）预处理后对载铁蛋白表达的影响;Lysotracker检测溶酶体活性;流式细胞仪量化细胞存活率;并定量组织蛋白酶L和组织蛋白酶B的活性。5.药物联合治疗对裸鼠异位移植瘤影响的研究:建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,观察药物联合治疗后小鼠体重和肿瘤大小的变化情况;药物治疗结束后收集肿瘤组织,通过H＆E染色检测肝癌组织病理改变和坏死情况;免疫组化检测Ki-67变化评价肿瘤细胞增殖状态;测定脂质过氧化代谢产物MDA的产生量变化。结果:1.青蒿琥酯和索拉非尼单独处理对肝癌细胞的杀伤作用不明显,但两者联合对肝癌细胞的杀伤效果显著提高,呈协同作用。凋亡抑制剂z-VAD不能有效保护联合处理导致的细胞死亡,但氧化应激抑制剂NAC可以有效保护。克隆形成实验进一步证明了药物联合处理对细胞克隆增殖能力有明显抑制作用。2.使用铁死亡相关的脂质过氧化抑制剂（liproxstatin-1）和铁螯合剂（deferoxamine mesylate）对细胞进行预处理后,索拉非尼联合青蒿琥酯处理所导致的细胞死亡减少,这提示了联合用药所导致的细胞死亡为铁死亡;脂质过氧化程度在药物联合下表现的更加明显;试剂盒检测结果显示脂质过氧化产物MDA含量升高和GSH的产量下降;进一步佐证了联合用药诱导铁死亡的发生。3.使用DCF或Mito Sox检测细胞内和线粒体ROS的产生,结果显示药物联合处理组和索拉非尼单独处理组的总ROS和线粒体ROS产量明显增加,表明索拉非尼是导致线粒体发生氧化应激反应的主要原因;与此同时检测发现线粒体膜电位降低,更重要的是,线粒体产生ATP的能力也被显著抑制;这一系列线粒体相关的改变可以被氧化应激抑制剂NAC逆转;Seahorse代谢仪结果显示ATP相关的呼吸OCR也出现相应的降低,而质子泵从线粒体外泄导致的呼吸OCR则增加。这一系列结果证明,索拉非尼以线粒体为主要靶点发挥对肝癌细胞的杀伤作用。4.通过对游离铁来源的检测发现载铁蛋白FTL和FTH在药物联合处理后被显著下调;而溶酶体抑制剂（Bafilomycin A1,Baf-A1）的预处理可以逆转上述改变;更重要的是,Baf-A1可以减轻联合用药导致的细胞死亡,提示溶酶体对于联合用药所导致的细胞死亡起到了关键作用;Lyso Tracker检测溶酶体活性,发现联合药物治疗之后,溶酶体活性增强;Magic Red试剂盒检测组织蛋白酶B/L的活性,结果显示溶酶体内蛋白酶活性增强;虽然青蒿琥酯单独也可增强溶酶体活性,但是与联合作用相比,程度较轻。此一系列结果提示溶酶体活性在青蒿琥酯联合索拉非尼所导致的肝癌细胞死亡中,起着重要作用。5.裸鼠体内试验证明,联合用药后一段时间内小鼠体重无明显差异,但异位移植瘤的体积在联合组出现明显的生长抑制,H＆E染色异位移植瘤切片显示坏死区域在联合组也明显扩大。采用免疫组化对Ki-67进行染色,结果显示肿瘤细胞增殖状态在联合组也受到明显抑制。而药物联合处理在体内也显著下调了铁死亡相关的FTL蛋白并增加了脂质过氧化产物MDA的含量。结论:1.索拉非尼联合青蒿琥酯对肝癌细胞的杀伤作用有协同效果,并且促进肝癌细胞死亡的方式是铁死亡而不是凋亡。2.索拉非尼联合青蒿琥酯对杀伤肝癌细胞具有协同作用,其分子机制主要体现于:索拉非尼影响线粒体功能和GSH的合成,而青蒿琥酯则通过激活溶酶体功能,从而促进转铁蛋白降解。两者协同导致了脂质过氧化、游离铁的释放和铁死亡,从而促进肝癌细胞走向铁死亡。3.裸鼠移植瘤体内试验进一步验证了索拉非尼联合青蒿琥酯对肝癌移植瘤的抑制作用效果,并证明联合用药可在肝癌移植瘤中诱导铁死亡。