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目的:探讨鹿茸多肽对正常状态下体外培养兔关节软骨细胞的合成代谢功能的影响;探讨正常体外培养兔关节软骨细胞凋亡及鹿茸多肽对其影响;探讨一氧化氮诱导的体外培养兔关节软骨细胞凋亡及鹿茸多肽对其影响。方法:1、建立兔关节软骨细胞体外培养体系,并用甲苯胺蓝染色进行软骨细胞鉴定建立软骨细胞体外培养体系:无菌条件下切取兔双侧髋、膝关节软骨并剪碎,用酶消化后收集细胞悬液于试管中,1000rpm,10min 离心后弃上清,加入含10%胎牛血清DMEM,以2×106/ml 接种于培养瓶中,置于37oC、5%CO2培养箱进行原代培养,并用甲苯胺蓝染色进行软骨细胞鉴定。原代细胞长满后传代培养。用于实验的软骨细胞为第1～2 代的传代细胞。2、将硝普钠加入软骨细胞培养体系,建立NO 诱导的软骨细胞凋亡模型,采用流式细胞术(Annexin V/PI 双参数法)和荧光染色法(吖啶橙染色)对软骨细胞凋亡进行定量、定性检测。首先,建立的兔关节软骨细胞凋亡模型:在软骨细胞培养体系中加入3mmol/L 的SNP(NO 供体),诱导兔关节软骨细胞凋亡,20h 左右软骨细胞凋亡率达到高峰。实验分4 组:正常组,正常组+鹿茸多肽,凋亡组,凋亡组+鹿茸多肽,每组设6 个复孔。流式细胞术检测及吖啶橙染色:用0.25%胰蛋白酶消化并收集各组软骨细胞,PBS 洗涤2 次,将每组细胞调至5×105 /ml,取1ml 细胞,将细胞重悬于200μl Binding Buffer,加入10μl Annexin-V-FITC 5μl PI,轻轻混匀,避光室温反应15min 或4oC 反应30min。加入300μl BindingBuffer,在1h 内上机检测。另外,将各组细胞悬浮于50μl PBS 中,加入100μl 吖啶橙染色液,置冰中染色30min 后,加入细胞固定液,于倒置荧光显微镜下观察。3、采用MTT 法测定软骨细胞增殖。