论文部分内容阅读
研究背景心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所造成的心肌坏死。尽管目前通过药物溶栓治疗、心脏介入支架及外科搭桥手术等临床治疗使急性心肌梗死患者的死亡率显著降低,但是随着社会的不断发展和生活水平的提高,心血管疾病的发生率也是越来越高,严重威胁着人们的身体健康。而且针对大量已经梗死及后续凋亡心肌细胞的损伤与修复等多种问题仍未能解决,从而导致心力衰竭的发生增加了患者的死亡风险。因此,如何保护受损后的心肌细胞,提高心肌梗死的治疗效果成为有待解决的一大问题。寻求治疗心肌梗死的新靶点,探索心肌梗死的发生机制,减少心肌梗死的死亡率,成为目前研究的热点。CD47又称为整合素相关蛋白(integrin-associatedprotein,IAP),是一种广泛分布在多种细胞表面上的高度糖化的跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族中的一员。CD47作为巨噬细胞表面抑制性受体信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)的配体,传递“不要吃我”的信号,从而阻止巨噬细胞对靶细胞的清除。研究显示几乎所有肿瘤细胞表面都会高表达CD47,与巨噬细胞表面的SIRPα结合后抑制其吞噬肿瘤细胞的功能,而CD47单克隆抗体的使用能够抑制肿瘤的生长和转移。最近研究认为CD47在动脉粥样硬化性疾病,缺血再灌注损伤等心血管疾病中高度表达,减弱巨噬细胞清除凋亡心肌细胞的能力,影响心肌损伤修复过程,这些研究为受损心肌细胞的修复治疗提供了新的方向和思路,但是在心肌梗死病理发展过程中CD47活化的动态特点以及具体活化机制尚未阐明。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在体内常通过磷酸化发挥非常重要的生物学功能,包括促进细胞的生长、调控细胞周期、维持细胞骨架的完整性及调节物质代谢等。研究表明,GSK-3β参与心肌调节的多个方面,如心肌肥大,心肌纤维化等。但对心肌梗死所导致的心肌损伤中凋亡细胞的清除及瘢痕的修复过程未见报道,并且它在心肌修复过程中有着怎样的作用也未见阐明。文献报道GSK-3β-NF-κB通路在细胞凋亡,炎症及肿瘤的发生等众多方面发挥着重要作用,且有文献证明NF-κB信号通路可调节乳腺癌细胞中CD47的表达。因此本课题推测,GSK-3β可能通过激活NF-κB信号通路参与心肌梗死后CD47的表达,从而参与心肌损伤修复的过程。研究目的本课题通过建立大鼠心肌梗死模型和离体心肌细胞缺氧模型,并利用GSK-3β抑制剂SB216763干预的方法,探讨GSK-3β参与心肌梗死后CD47表达变化的分子机制,从而为心肌梗死后心肌细胞的免疫修复寻找新思路和新的治疗靶点。研究方法1.建立大鼠心肌梗死模型:利用结扎左冠状动脉前降支的方法制备大鼠急性心肌梗死7天和28天模型。将SD大鼠随机分为三组,sham组(假手术组)仅开胸并在左冠状动脉前降支下穿线,MI组(手术组),SB+MI组(手术前一小时尾静脉注射GSK-3β抑制剂SB216763(0.6mg·kg·d-1),连续注射7天)。每组分别于术后7天、28天取材,收集大鼠心脏左心室组织标本。2.检测并观察心脏形态变化:利用免疫组化H&E染色和超声心动图的方法检测心脏的组织形态及心功能变化。3.免疫荧光的方法检测大鼠心肌梗死7天后心脏组织中CD47阳性表达率;荧光定量PCR,western bolt的方法分别检测大鼠心肌梗死组织CD47和NF-κB mRNA和蛋白水平的表达变化。4.用新生大鼠原代心肌细胞(rat primary cardiomyocytes,RCMs)和大鼠心肌细胞株H9c2细胞建立细胞缺氧模型。分为:NC(空白对照组),缺氧组(6h、12h、24h、48h),GSK-3β 抑制剂 SB216763(10μM)处理组(SB/6h、SB/12h、SB/24h、SB/48h),NF-κB 抑制剂 SN-50(18μM)处理组(SN50/12h),CD47单克隆抗体(10μM)处理组(CD47/12h),GSK-3β抑制剂SB216763和CD47单克隆抗体同时处理组(SB/CD47/12h)。5.采用western bolt的方法分别检测缺氧细胞CD47和NF-κB蛋白水平的表达变化,并使用流式细胞仪检测缺氧RCMs和H9c2细胞的凋亡情况。实验结果1.抑制GSK-3β能够减轻心肌梗死后心肌功能障碍利用H&E染色和超声心动图的方法观察GSK-3β抑制剂对大鼠心梗组织的形态学和心功能的影响。结果显示,术后7天MI组出现心肌细胞排列紊乱、间质性出血、炎性细胞浸润,而SB+MI组HE染色结果显示可有效减轻心肌细胞的损伤。术后7天的超声心动图结果显示,MI组左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、每搏输出量(SV)均明显降低(p<0.05,n=5),而SB+MI 组的 LVEF、LVFS、SV 均比 MI 组升高(p<0.05,n=5);MI 组左心室舒张未期内径(LVED)明显高于sham组(p<0.001,n=5),而SB+MI组LVED明显低于MI组(p<0.001,n=5)。结果表明,抑制GSK-3β可以改善心肌梗死后心肌细胞的形态变化和心功能障碍。2.抑制GSK-3β引起大鼠心肌梗死后CD47表达上调的减少利用免疫荧光的方法检测大鼠心肌梗死7天后心脏组织中CD47阳性细胞率,结果显示MI组CD47阳性细胞数明显高于sham组(p<0.001,n=3),而GSK-3β抑制剂处理组CD47的阳性细胞数明显低于MI组(p<0.001,n=3)。利用荧光定量PCR和westernblot的方法分别检测大鼠心梗组织中CD47的mRNA和蛋白表达量。结果显示,在术后7天和28天心梗组织中,与sham组相比,CD47 mRNA(p<0.01,n=7)和蛋白(p<0.01,n=7)的表达量均显著升高,GSK-3β抑制剂处理后CD47的mRNA(p<0.05,n=7)和蛋白(p<0.05,n=7)的表达量均明显下调。结果表明,大鼠心肌梗死后受损组织的CD47表达明显升高,而靶向GSK-3β可缓解受损组织中CD47表达的升高。3.抑制GSK-3β可减弱缺氧心肌细胞中CD47蛋白表达的上调分别建立新生大鼠原代心肌细胞(RCMs)和大鼠心肌细胞株(H9c2)的缺氧模型,结果显示,在RCMs细胞缺氧12h时CD47蛋白表达升高(p<0.01,n=3),GSK-3β抑制剂处理后CD47蛋白的表达明显下降(P<0.05,n=3)。同样,在 H9c2 细胞缺氧 12h(p<0.01,n=3)和 24h(p<0.05,n=3)时,CD47 蛋白表达升高,加入GSK-3β抑制剂后CD47蛋白表达下降(p<0.05,n=3)。利用流式细胞术分别检测缺氧心肌细胞RCMs和H9c2的凋亡率,结果显示在缺氧12h 时,RCMs(p<0.01,n=3)和 H9c2(p<0.01,n=3)细胞的凋亡率明显增高,抑制 GSK-3β 后能够减少缺氧 RCMs(p<0.05,n=3)和 H9c2(p<0.01,n=3)细胞的凋亡。4.GSK-3β通过激活NF-κB参与CD47表达的上调利用荧光定量PCR和western blot的方法分别检测大鼠心肌梗死后受损组织和缺氧心肌细胞中NF-κB的表达量。结果显示,在术后7天和28天大鼠心梗组织中,与 sham 组相比,NF-κB mRNA(p<0.01,n=7)和蛋白(p<0.01,n=7)表达量显著升高,GSK-3(β抑制剂处理后NF-κBmRNA(p<0.01,n=7)和蛋白(p<0.05,n=7)表达量明显下调。在RCMs和H9c2细胞缺氧12h时NF-κB蛋白表达升高(p<0.01,n=3),加入GSK-3β抑制剂后明显下降(p<0.05,n=3)。实验进一步利用NF-κB抑制剂SN50(18μM)预处理缺氧RCMs细胞,结果显示心肌细胞缺氧12h时CD47蛋白表达量明显升高(p<0.05,n=3),NF-κB抑制剂处理后CD47蛋白表达明显降低(p<0.05,n=3)。同时利用流式细胞术分别检测缺氧心肌细胞RCMs和H9c2的凋亡率,结果显示加入NF-κB抑制剂后能够明显降低RCMs(p<0.05,n=3)和H9c2(p<0.01,n=3)缺氧细胞的凋亡率。5.抑制GSK-3β和CD47降低缺氧心肌细胞的凋亡实验进一步比较了单独使用CD47抗体或与GSK-3β抑制剂联合处理对缺氧心肌细胞凋亡率的影响,结果显示与单独使用CD47单克隆抗体处理缺氧细胞相比,二者联合处理细胞会明显减少缺氧细胞的凋亡率(P<0.05,n=3)。结论1.GSK-3β通过激活NF-κB调控大鼠心肌梗死后心脏组织中CD47的表达上调,进而引起心肌细胞的损伤和凋亡;2.同时靶向GSK-3β和CD47可明显降低缺氧心肌细胞的凋亡。