有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)级联在植物生长发育、抗病和抗逆反应过程中发挥至关重要的作用。目前，植物中MAPK级联的作用机理主要来自对双子叶植物拟南芥的研究，对水稻MAPK级联的研究非常少。水稻(Oryza sativa)是重要的粮食作物，还是单子叶模式植物。本课题利用最新的序列特异核酸酶(Sequence specific nucleases，SSN) TALEN和CRISPR/Cas9系统创制7个OsMKK和17个OsMPK家族成员的定点敲除突变体。通过对突变体的表型进行筛选分析，试图系统研究水稻MKKs和MPKs各成员的功能并探讨水稻MAPK级联可能参与的发育和抗逆过程的作用机制。MAPK级联的机理研究为水稻育种和品质改良提供理论支持和候选基因。课题研究主要取得了以下结果:　　一、实现了OsMKK和OsMPK家族所有成员的定点敲除。利用TALEN和CIRSPR/Cas9系统对OsMKK家族7个成员和OsMPK家族的17个成员进行定点敲除。连续多代筛选获得除纯合突变致死的OsMKK6、OsMPK4和OsMPK6以外的所有成员的移码突变纯合体。T0检测到的突变可以通过自交遗传到后代，通过遗传分离可在T1或T2代植物中筛选出不含转基因载体的纯合突变体。　　二、OsMKK和OsMPK两个家族的24个成员中的10个基因利用TALEN进行敲除，其T0代转基因植物突变效率从7.1％到23.7％;14个基因利用CRISPR/Cas9进行敲除，其突变效率为25％到100％。因此，CRISPR/Cas9系统的突变效率显著高于TALEN，而且CRISPR/Cas9系统可以在水稻中实现多位点敲除。另外，脱靶效应上，在T0代植物中检测TALEN的29个和CRISPR/Cas9的58全基因组潜在脱靶位点，发现TALEN诱导的T0代突变植物中没有检测到脱靶现象;CRISPR/Cas9系统诱导的T0代突变体中检测到2个sgRNA存在脱靶。因此，TALEN在水稻基因组编辑中比CRISPR/Cas9系统特异性高。　　三、OsMKK6-OsMPK4级联控制水稻种子发育。在多个世代中均未能检测到osmkk6和osmpk4纯合突变体。Os MKK+/-和OsMPK4+/-杂合突变体能够产生正常的花粉和胚囊，杂合体自交的种子近半数胚乳发育异常，种子皱缩。将授粉20-25天的种子播种于1/2MS培养基上，约1/4种子不能萌发，分离鉴定胚基因型为纯合体，因此，osmkk6和osmpk4纯合致死。杂合体种子约1/2皱缩，胚乳发育有亲本效应。Realtime-PCR结果显示OsMKK6和OsMPK4在营养器官中高量表达。在水稻原生质体中OsMKK6:GFP和OsMPK4:GFP两个融合蛋白主要定位于细胞核中，在细胞质中也有少量分布。酵母双杂交和水稻原生质体BiFC实验证明OsMKK6和OsMPK4可以在异源系统和水稻细胞内互作。体外磷酸化实验证明OsMPK4是OsMKK6DD(组成型激活形式OsMKK6)的直接底物。生化和遗传实验结果表明OsMKK6-OsMPK4级联参与水稻种子发育的调控。　　四、以OsMPK4-CA(组成型激活形式OsMPK4)为诱饵蛋白，利用酵母双杂交在水稻cDNA文库筛选得到43个OsMPK4-CA的互作蛋白，命名为OsMIPs(OsMPK4-CA Interacting Proteins，MIPs)。挑选其中四个全长互作的基因和另外3个基因进行了超表达和CRISPR/Cas9敲除。其中，T0代osmip5突变体花器官发育异常:生殖器官转变为营养器官，部分突变株系表现出颖壳开裂子房裸露等表型，而且osmip5不能产生正常种子。　　五、对osmkks和osmpks的部分成员进行表型筛选。初步结果发现:osmkk4水稻种子变小;OsMKK1和OsMKK3参与水稻种子的休眠调控;osmpk11对干旱处理敏感;osmpk21-1表现出抗旱表型。　　因此，TALEN和CRISPR/Cas9系统是高效的基因组编辑工具。本研究通过敲除MAPK级联两个家族所有成员来研究MAPK级联的功能，为水稻功能基因组的研究提供了新的途径。