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芽孢杆菌及其胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)可以调节肠道微生态平衡,改善机体免疫能力,然而,由于其益生作用机制尚未完全阐明,限制了芽孢杆菌及其EPS在动物饲料生产中的精准使用。本研究通过筛选获得一株产抑制肠产毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)血凝性EPS的解淀粉芽孢杆菌,并对EPS的结构进行解析,研究EPS对典型肠道病原微生物ETEC的抑制作用与机理,探索EPS对定向增殖乳酸菌的调控作用,最后考察EPS对Pb2+诱导肠道氧化损伤的保护作用,阐明芽孢杆菌EPS的益生作用。本研究为芽孢杆菌EPS应用于防治动物应激,取消养殖端抗生素的使用提供科学的理论依据,并为其EPS作为新型饲料添加剂,实现其在养殖过程中的精准调控提供新的思路。论文主要结论如下:(1)从健康仔猪粪便中分离获得一株产抑制ETEC血凝性EPS的芽孢杆菌,采用基于16S rRNA测序和常规生理生化试验,鉴定其为解淀粉芽孢杆菌JN4(Bacillus amyloliquefaciens JN4)。解淀粉芽孢杆菌JN4的EPS在4 g·L-1时就能抑制ETEC的血凝性,通过DEAE Sepharose FF和Sepharose CL-6B对其进行分离纯化,获得高ETEC血凝性抑制活力的多糖EPS-JN4,回收率为90.2%。多糖EPS-JN4的分子量为8 kDa,聚合度约为50,单糖组成为葡萄糖和果糖,其摩尔比为1:46.1,表明多糖EPS-JN4是一种分子量较小的果聚糖。进一步采用傅里叶红外光谱分析,甲基化分析和核磁共振分析等技术,推定多糖EPS-JN4是一种含有支链的左聚糖,含有7个重复单元,每个重复单元含5个(2→6)-β-D-果糖基和1个(1,2→6)-β-D-果糖基作为分支点,侧链连接着1个2-β-D-果糖基。多糖EPS-JN4和其它类型的果聚糖相比,具有更高的抑制ETEC血凝性的活力。(2)多糖EPS-JN4可以充当受体类似物与ETEC细胞黏附素结合,从而抑制ETEC在肠道细胞上黏附。多糖EPS-JN4可以抑制ETEC生长,推迟其进入对数生长期,但不能完全杀灭ETEC。对多糖EPS-JN4的抑菌机制研究表明,它是通过和ETEC黏附,抑制ETEC的呼吸代谢作用,从而延缓其生长和代谢。多糖EPS-JN4还可以降低由ETEC介导的促炎基因的表达,并降低ETEC对抑炎基因表达的抑制作用,从而减缓ETEC介导的炎症反应。此外,多糖EPS-JN4和低聚半乳糖具有协同作用,可以联合使用降低ETEC在肠道细胞上的黏附率。(3)多糖EPS-JN4能够抵抗动物消化系统α-淀粉酶和胃酸的降解,从而保证它进入肠道后可以发挥应有的作用。动物实验表明,多糖EPS-JN4对小鼠肠道菌群中的乳杆菌属具有增殖作用,特别是对罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)具有特异性的增殖作用。罗伊氏乳杆菌JN101利用多糖EPS-JN4的生长速率较葡萄糖慢,但最终菌浓差异不明显,主要代谢产物乳酸较葡萄糖组降低了10.5%,但乙酸含量提高了23.9%。多糖EPS-JN4增殖的罗伊氏乳杆菌JN101的肠道耐受性显著提高,表面疏水性提高了73.5%,肠道黏附率相对提高了2.6倍;同时其细胞膜蛋白和脂类物质含量提高了40.2%和104.8%,其中,C18不饱和脂肪酸提高了86.8%;此外,S-表层蛋白和延伸因子EF-Tu分别提高了2.2倍和1.6倍,是其在肠道细胞上更易黏附的重要因素。(4)代谢组学分析表明,多糖EPS-JN4和葡萄糖增殖罗伊氏乳杆菌JN101的代谢物存在显著差异,其中13种代谢物含量增加,如N-乙酰-精氨酸,葡萄糖苷和3-磷酸甘油酯分别上调了112.36,84.51和19.62倍。代谢通路分析表明,精氨酸合成和代谢通路是不同碳源增殖罗伊氏乳杆菌JN101的重要差异点,鞘脂类和磷酸甘油酯的代谢通路导致细胞膜组成差异,而乙醛酸和二元酸的代谢通路导致胞外乳酸和短链脂肪酸含量差异。(5)多糖EPS-JN4具有清除超氧自由基,清除羟自由基和抑制脂质过氧化等抗氧化活性,可以抑制各种自由基导致的DNA断裂。多糖EPS-JN4可以捕获Pb2+诱导细胞代谢产生的自由基,提高细胞抗氧化酶系活力,阻止细胞膜脂质过氧化损伤,进而提高细胞的存活率。多糖EPS-JN4还可以直接吸附Pb2+避免其诱导的肠道氧化损伤。吸附热力学分析表明吸附过程符合Langmuir模型,Qmax为53.2 mg·g-1。吸附动力学分析表明吸附是一个快速、高效的过程,符合拟二级动力学方程,在100 min时已达到平衡吸附量的93.1%,并在240 min左右达到平衡值。傅里叶-红外光谱研究表明,多糖EPS-JN4主要通过羟基和羧基等基团来吸附Pb2+。