论文部分内容阅读
CAD是由天冬氨酸转氨甲酰酶（ATC）、二氢乳清酸酶（DHO）与氨甲酰磷酸合成酶2（CPS-2）形成的单一多酶蛋白,参与嘧啶核苷酸合成,CAD突变会导致神经系统疾病和遗传性代谢疾病的发生,而CAD的过度激活会诱发癌症。蛋白质的泛素化是一种常见的翻译后修饰方式,几乎参与了一切生命活动的调控,它在蛋白质的降解、代谢和功能调节中不可或缺。CHIP作为一种E3泛素连接酶,可参与多种底物蛋白的泛素化修饰,并促进底物蛋白的降解。目前,关于CAD蛋白的泛素化修饰机制尚不清楚。本文旨在探究泛素连接酶CHIP调控CAD蛋白降解的分子机制,以及CHIP在结肠癌中的抑癌作用。本论文以HEK293T细胞和HCT116细胞作为研究材料,通过慢病毒包装的方法构建稳转细胞系。本研究通过免疫共沉淀实验（CO-IP）检测到CHIP蛋白与CAD蛋白有相互作用。通过构建CHIP及CAD的结构域载体以及CO-IP试验,实验结果表明CAD是通过GLN/CPSⅡ结构域、ATC结构域与CHIP的TPR结构域相互作用;我们进一步采用Denature IP实验方法,发现CHIP能显著促进CAD的泛素化;另外,蛋白免疫印迹实验表明CHIP能够通过蛋白酶体途径促进结肠癌细胞系HCT116中CAD蛋白的降解;已有研究表明,CHIP有两个功能位点,分别是K30（Hsc70相互作用位点）和H260（催化活性位点）。因此,我们构建了CHIP两个功能位点的突变体,发现CHIP两个功能位点对于CHIP调控CAD是必要的;研究证实,CAD的蛋白水平上调与癌症的发生密切相关,所以我们通过克隆形成实验、细胞增殖实验以及细胞划痕实验来检测CHIP对HCT116细胞的克隆形成、增殖和迁移的影响,实验结果表明CHIP抑制HCT116细胞的克隆形成和细胞增殖,但对HCT116细胞的细胞迁移无显著影响。综上所述,CHIP是CAD蛋白的E3泛素连接酶,在结肠癌细胞中通过蛋白酶体途径降解CAD,CHIP抑制结肠癌细胞的克隆形成和细胞增殖。本研究为进一步探究调控CAD的分子机制提供了一定的理论基础,为肿瘤治疗提供新的思路。